Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door Grant 31003A-162643 door de Zwitserse National Science Foundation. Wij danken Nicole Beuret en de Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) voor steun.

1. bacteriële transformatie met matiemaatschappij Nanobodies
Opmerking: Dit protocol is geoptimaliseerd voor de expressie, zuivering en analyse van matiemaatschappij anti-GFP nanobodies als eerder beschreven30. Bewerking met andere eiwit wordt wellicht wijziging van dit standaard protocol.
<ol><li>Ontdooien van chemocompetent bacteriën (~ 100 µL) geschikt voor eiwit expressie (bijvoorbeeld Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) cellen) door z...

Nanobodies vertegenwoordigen een opkomende klasse van eiwitten binder steigers met vele voordelen ten opzichte van conventionele antilichamen: ze zijn kleine, stabiele, monomeer, kunnen worden geselecteerd voor hoge affiniteit en ontbreken bisulfide obligaties33,35, 44 , 45. ze worden gebruikt in een aantal toepassingen, zoals in cel cultuur systemen en organismen in Ontwikkelingsbiologie<sup c...

Retrograde verkeer van eiwitten en lipiden van het celoppervlak aan verschillende intracellulaire compartimenten is van cruciaal belang voor handhaving van de membraan homeostase tegenwicht secretie en recycleren van onderdelen van anterograde vervoer machineries1 , 2. na de internalisering via clathrin-afhankelijke of -onafhankelijke endocytose, eiwit en lipide-vracht vullen eerst vroeg Endosomen uit waar ze verdere zijn doorverwezen hetzij langs de endo-lysosomale systeem, gerecycleerd aan het plasma-membraan, of gericht aan de trans-Golgi network (TGN). Recycling van Endosomen en/of het celoppervlak naar de TGN maakt deel uit van de functionele cyclus van een aantal anterograde transmembraan lading receptoren, zoals de catie-afhankelijke en catie-onafhankelijke mannose-6-fosfaat receptoren (CDMPR en CIMPR) leveren nieuw gesynthetiseerd lysosomale hydrolases uit de TGN te laat Endosomen en lysosomen3,4,5, sortilin en SorLA6,7, Wntless (WLS) vervoer van Wnt liganden aan het celoppervlak 8 , 9 , 10 , 11. andere eiwitten ontvangen terug naar de TGN zijn TGN46 en haar aanverwante isoforms12,13,14, SNAREs (oplosbare N- ethylmaleimide-gevoelige fusion factor bijlage receptoren) 15 , 16 , amyloïde precursor eiwit (APP)18,19, progressieve ankylose (ANK) eiwit20, 17, metalen vervoerders zoals ATP7A/B of DMT121,22, en transmembraan verwerking van enzymen waaronder carboxypeptidase D, furin of BACE123,24,25. Afgezien van deze endogene proteïnen kapen bacteriële en plant toxines (bv, Shiga en cholera-toxine, ricine en Abrine) retrograde vervoer machines om te bereiken van de ER voor retrotranslocation in het cytosol26,27, 28,29.
Om direct retrograde verkeer analyseren, hebben we eerder een nanobody gebaseerde toolkit om te etiketteren en volg lading eiwitten van het celoppervlak naar intracellulaire compartimenten30ontwikkeld. Nanobodies vertegenwoordigen een nieuwe familie van eiwit bindmiddelen afgeleid van homodimeric zware-keten-alleen antilichamen (hcAbs) die van nature in kameelachtigen en cartilaginous vissen31,-32 voorkomen. Zij vormen het veranderlijke domein voor zware-keten (VHH) van hcAbs en hebben veel voordelen boven conventionele antilichamen (bijvoorbeeld IgGs): ze zijn monomeer, kleine (~ 15 kDa), zeer goed oplosbaar, verstoken van disulfide bindingen, kan worden bacterially uitgedrukt, en geselecteerd voor hoge-affiniteit bindende33,34,35,,36. Om onze tool nanobody veelzijdig en breed toepasbare, we matiemaatschappij anti-GFP nanobodies aan oppervlak-label en track eiwitten gelabeld met GFP op hun extracellulaire/lumenal domein gebruikt. Door functionalization van nanobodies met mCherry, ascorbaat peroxidase 2 (APEX2)37, of tyrosine sulfation (TS) sequenties, retrograde vervoer van bonafide transmembraan lading eiwitten kan worden geanalyseerd door een vaste en live cel imaging, door elektronenmicroscopie, of biochemically. Aangezien tyrosine sulfation gemedieerd door tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 en TPST2) een posttranslationele wijziging beperkt tot de trans-Golgi is/TGN, we kan rechtstreeks studie vervoer en kinetiek van proteïnen van belang uit het celoppervlak daartoe intracellulaire Golgi compartiment38,39,40.
In dit artikel methoden beschrijven we het gemak van de productie van matiemaatschappij nanobodies (VHH-2xTS - APEX2, - mCherry en derivaten) geschikt voor een aantal toepassingen voor het analyseren van retrograde vervoer in zoogdiercellen30. We vooral gericht op het gebruik van TS site-gewijzigd nanobody voor analyse van het intracellulair verkeer van het celoppervlak tot het compartiment van de sulfation.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Vervoer van eiwitten en membranen van het celoppervlak naar het Golgi en daarbuiten is essentieel voor de homeostase, organel identiteit en fysiologie. Studeren retrograde eiwit verkeer, hebben we onlangs een veelzijdig nanobody gebaseerde toolkit voor het analyseren van vervoer van het celoppervlak naar het Golgi-complex, hetzij door vaste en levende cel imaging, door elektronenmicroscopie of biochemically ontwikkeld. We ontworpen matiemaatschappij anti-groen fluorescente proteïne (GFP) nanobodies — kleine monomeer, hoge-affiniteit eiwit bindmiddelen — dat kan worden toegepast op cellijnen uiting van membraaneiwitten van belang met een extracellulaire GFP-groep. Derivatized nanobodies gebonden aan het GFP-verslaggevers specifiek zijn geïnternaliseerd en piggyback op de reporters sorteren traject vervoerd. Nanobodies waren matiemaatschappij met fluorophores te volgen retrograde vervoer door fluorescentie microscopie en beeldbewerking, met ascorbaat peroxidase 2 (APEX2) om te onderzoeken de ultrastructurele lokalisatie van verslaggever-nanobody complexen door elektron live microscopie, en met tyrosine sulfation (TS) motieven om te beoordelen van de kinetiek van trans-Golgi network (TGN) aankomst. In deze methodologische artikel duidelijk naar voren komt de algemene procedure bacterially express en zuiveren matiemaatschappij nanobodies. We illustreren de krachtige gebruik van onze tool met behulp van de mCherry - en TS-gemodificeerde nanobodies endocytotische opname en TGN komst van lading eiwitten te analyseren.

Om te onderzoeken retrograde eiwit transport naar diverse intracellulaire bestemmingen, hebben we onlangs een anti-GFP nanobody gebaseerde instrument om te etiketteren en volg recombinante fusion eiwitten van de cel-oppervlakte30opgericht. Hier tonen we de bacteriële productie van dergelijke derivatized nanobodies en tonen hun toepassing te bestuderen endocytotische ICT door fluorescentie microscopie en immunoblotting, alsmede het gebruik ervan te onderzoeken TGN ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse van endocytotische opname en Retrograde Transport naar het netwerk van de Trans-Golgi matiemaatschappij Nanobodies, waarbij in gekweekte cellen

Retrograde vervoer van eiwitten uit het celoppervlak naar het Golgi is essentieel voor het handhaven van de membraan homeostase. Hier beschrijven we een methode om biochemically cel oppervlak-te-Golgi vervoer van recombinante eiwitten matiemaatschappij nanobodies met HeLa cellen te analyseren.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Deze methode maakt de productie en toepassing van bacteriële uitgedrukte, gefunctionaliseerde nanolichamen mogelijk om retrograde eiwittransport van het celoppervlak naar intercellulaire compartimenten te analyseren. In het bijzonder het Trans-Golgi netwerk. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gebruik van sulfatie. Een zeer specifieke, gecompartimenteerde en gevoelige post-vertaling wijziging om reporter nano-body complexe aankomst in het DTN-compartiment te beoordelen. Deze methode in combinatie met andere afgeleide nanolichamen voor levenscelbeeldvorming en elektronenmicroscopie kan ook worden gebruikt om endocitische processen van ziektegerelateerde celoppervlaktereceptoren te bestuderen. Ons repertoire van gefunctionaliseerde nanolichamen is ontworpen om retrograde transport in gekweekte cellen te bestuderen. Deze hulpmiddelen kunnen echter ook worden toegepast in meercellige organismen. Om deze procedure te beginnen, kies een bacteriële kolonie met de vector van belang van de plaat en inent een fles met 20 milliliter LB medium aangevuld met antibiotica. Incubeer 's nachts op 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stikstof cavitatie en differentiële centrifugeren zorgt voor de verdeling van perifere membraaneiwitten in gekweekte cellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyses van mitochondriale Calcium toestroom in geïsoleerde Mitochondria en gekweekte cellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse van de vouwing van eiwitten, vervoer en afbraak in levende cellen door radioactieve Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtheidsgradiënt Ultracentrifugatie voor onderzoek naar endocytische recycling in zoogdiercellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: Een gestroomlijnde toepassing voor eiwit co-expressie clustering en netwerkanalyse in proteomics

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinematige verzameling van cryo-EM-datasets met hoge resolutie met behulp van 200 KV transmissie-elektronenmicroscoop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulaire glucosedepletie als een indirecte maat voor glucoseopname in cellen en weefsels Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...