Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par Grant 31003A-162643 par la Swiss National Science Foundation. Nous remercions Nicole Beuret et le Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pour la prise en charge.

1. bactérienne Transformation avec Nanocorps fonctionnalisés
Remarque : Ce protocole a été optimisé pour l’expression, purification et analyse des fonctionnalisées anti-GFP nanocorps comme décrit précédemment30. Dérivation avec les autres fractions de protéine peut nécessiter une modification du présent protocole standard.
<ol><li>Décongeler les bactéries chemocompetent (~ 100 µL) adaptés à l’expression de la protéine (par exem...

Nanocorps représentent une nouvelle classe d’échafaudages de liant de protéine avec nombreux avantages par rapport aux anticorps traditionnels : ils sont petits, stable, monomère, peuvent être sélectionnés pour les obligations de haute affinité et manque le disulfure33,35, 44 , 45. ils sont utilisés dans un certain nombre d’applications, tels que dans les systèmes de cultures cel...

Le trafic rétrograde des protéines et des lipides de la surface de la cellule aux différents compartiments intracellulaires est crucial pour le maintien de l’homéostasie de la membrane afin de contrebalancer la sécrétion et de recycler les composants d’antérograde transport machineries1 , 2. après internalisation par endocytose clathrine dépendant ou - indépendant, cargaison de protéines et de lipides commencez par remplir tôt endosomes d'où ils sont encore redirigé soit le long du système endo-lysosomale, recyclé à la membrane plasmique, ou ciblées au réseau trans-Golgi (TGN). Recyclage des endosomes et/ou la surface de la cellule vers le TGN fait partie du cycle fonctionnel d’un certain nombre de récepteurs transmembranaires fret antérograde comme les récepteurs de mannose-6-phosphate cation-dépendants et indépendants de cation (CDMPR et CIMPR) de livraison nouvellement synthétisé hydrolases lysosomales de la TGN à fin endosomes et lysosomes3,4,5, sortiline et SorLA6,7, Wntless (WLS) transportant des ligands Wnt à la surface des cellules 8 , 9 , 10 , 11. autres protéines récupérées vers le TGN sont TGN46 et ses isoformes connexes12,13,14, SNAREs (récepteurs solubles de fixation de fusion - éthylmaléimide-sensible-facteur des N) 15 , 16 , 17, précurseur de l’amyloïde (APP) de protéines18,19, ankylose progressive (ANK) protéines20métalliques transporteurs transmembranaires et comme ATP7A/B ou DMT121,22, traitement des enzymes dont la carboxypeptidase D, la furine ou BACE123,24,25. En dehors de ces protéines endogènes, les toxines bactériennes et végétales (p. ex., toxine de Shiga et le choléra, ricine et abrin) détournent les mécanismes de transport rétrograde pour atteindre l’ER pour retrotranslocation dans le cytosol26,,27, 28,29.
Afin d’analyser directement les trafic rétrograde, nous avons précédemment développé un ensemble d’outils axés sur les nanobody pour étiqueter une suivre protéines cargo de la surface de la cellule à compartiments intracellulaires30. Nanocorps représentent une nouvelle famille de protéines liants dérivés de homodimérique heavy-chain-seulement anticorps (hcAbs) qui se produisent naturellement dans les poissons cartilagineux et camélidés31,32. Ils constituent le domaine variable de chaîne lourde (HHV) de hcAbs et ont de nombreux avantages par rapport aux anticorps traditionnels (p. ex., IgG) : ils sont monomères, petit (~ 15 kDa), hautement soluble, dépourvu de ponts disulfures, peut être exprimée par les bactéries et sélectionné pour liaison de haute affinité33,34,35,36. Pour rendre notre outil nanobody polyvalente et largement applicable, nous avons utilisé fonctionnalisés anti-GFP nanocorps aux protéines de surface-étiquette et piste taggés GFP à leur domaine extracellulaire/lumière. Par fonctionnalisation de nanocorps avec mCherry, peroxydase d’ascorbate 2 (APEX2)37, ou séquences de tyrosine de sulfatation (TS), transport rétrograde des protéines transmembranaires de cargaison de bonne foi peut être analysé par soit fixe et imagerie cellulaire, en direct de microscopie électronique, ou biochimique. Puisque la sulfatation tyrosine médiée par des sulfotransférases tyrosylprotéine (TPST1 et TPST2) est une modification post-traductionnelle restreinte pour le trans-Golgi/TGN, nous pouvons étudier directement transport et la cinétique des protéines d’intérêt de la surface de la cellule à cette intracellulaire Golgi compartiment38,39,40.
Dans cet article des méthodes, nous décrivons la facilité de production des nanocorps fonctionnalisés (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry et dérivés), adapté pour un certain nombre d’applications pour analyser le transport rétrograde dans les cellules de mammifères,30. Nous nous concentrons principalement sur l’utilisation de TS site-modifié nanobody pour l’analyse du trafic intracellulaire de la surface cellulaire vers le compartiment de sulfatation.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transport des protéines et les membranes de la surface de la cellule à l’appareil de Golgi et au-delà est essentiel pour l’homéostasie, l’identité de l’organite et physiologie. Afin d’étudier les protéines rétrograde trafic, nous avons récemment développé une boîte à outils polyvalent basé sur nanobody pour analyser des transports de la surface cellulaire pour le complexe de Golgi, soit par l’imagerie fixe et de cellules vivantes, en microscopie électronique, ou biochimique. Nous avons conçu le nanocorps fonctionnalisés anti-vert protéine fluorescente (GFP) — reliures petit, monomère, haute affinité des protéines — qui peut être appliqué aux lignées de cellules exprimant des protéines de la membrane d’intérêt avec une portion extracellulaire de GFP. Nanocorps dérivés liés aux reporters GFP sont spécifiquement internalisés et transporté piggyback le long des routes de tri des journalistes. Nanocorps ont été fonctionnalisés avec des fluorophores à suivre le transport rétrograde en microscopie par fluorescence et de vivre l’imagerie, avec peroxydase d’ascorbate 2 (APEX2) pour étudier la localisation ultrastructurale de journaliste-nanobody complexes par les électrons microscopie et avec des motifs de sulfatation (TS) de tyrosine pour évaluer la cinétique d’arrivée du réseau (TGN) trans-Golgi. Dans cet article méthodologique, nous décrivons la procédure générale pour exprimer par les bactéries et de purifier nanocorps fonctionnalisés. Nous illustrons l’utilisation puissante de notre outil à l’aide de la nanocorps mCherry - et TS-modification pour analyser l’absorption endocytose et arrivée de TGN des protéines de la cargaison.

Afin d’étudier le transport des protéines rétrograde vers diverses destinations intracellulaires, nous avons récemment créé un outil anti-GFP nanobody pour étiqueter des protéines de fusion recombinantes découlent de la surface cellulaire30. Ici, nous démontrons la production bactérienne de ces dérivés nanocorps et démontrer leur application pour étudier l’absorption endocytose par microscopie à fluorescence et immunoblotting, ainsi que leur uti...

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse de l’endocytose absorption et Transport rétrograde au réseau Trans-Golgi dans des cellules cultivées à l’aide de Nanocorps fonctionnalisés

Transport rétrograde des protéines de la surface de la cellule de l’appareil de Golgi est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la membrane. Nous décrivons ici une méthode pour analyser biochimiquement transport de surface-à-Golgi cellulaire des protéines recombinantes, nanocorps fonctionnalisés dans les cellules HeLa.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Cette méthode permet la production et l’application de nano-corps bactériens exprimés et fonctionnalisés pour analyser le transport rétrograde des protéines de la surface cellulaire vers les compartiments intercellulaires. En particulier le réseau Trans-Golgi. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de la sulfation. Une modification post-traduction très spécifique, compartimentée et sensible pour évaluer l’arrivée d’un complexe nano-corps de reporter dans le compartiment DTN. Cette méthode, combinée à d’autres nano-corps dérivatisés pour l’imagerie cellulaire de vie et la microscopie électronique, peut également être utilisée pour étudier les processus endocitiques des récepteurs de surface cellulaire liés à la maladie. Notre répertoire de nano-corps fonctionnalisés a été conçu pour étudier le transport rétrograde dans les cellules de culture. Cependant, ces outils peuvent également être appliqués dans des organismes multicellulaires. Pour commencer cette procédure, choisissez une colonie bactérienne contenant le vecteur d’intérêt de la plaque et inoculer un flacon contenant 20 millilitres de LB moyen complété par des antibiotiques. Incuber toute la nuit à 37

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