Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von Grant 31003A-162643 durch den Schweizerischen Nationalfonds unterstützt. Wir danken Nicole Beuret und das Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) für die Unterstützung.

(1) bakterielle Transformation mit funktionalisierten Nanobodies
Hinweis: Dieses Protokoll wurde für den Ausdruck, Reinigung und Analyse von funktionalisierten Anti-GFP Nanobodies wie zuvor beschrieben30optimiert. Derivatisierung mit anderen Protein Moieties erfordern Änderung des standard-Protokoll.
<ol><li>Auftauen von Chemocompetent Bakterien (~ 100 µL) geeignet für Protein-Expression (z. B. Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) Zellen) ...

Nanobodies repräsentieren eine neue Klasse von Protein Bindemittel Gerüsten mit viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörper: sie sind klein, stabil, Monomere, kann ausgewählt werden, denn hohe Affinität und fehlende Disulfid33,35, Anleihen 44 , 45. sie dienen in einer Reihe von Anwendungen, wie z. B. in Zellkultursystemen und Organismen in der Entwicklungsbiologie...

Retrograde Verkehr von Proteinen und Lipiden von der Zelloberfläche an verschiedenen intrazellulären Kompartimenten ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase der Membran, Sekretion auszugleichen und Komponenten von Anterograde Transport Maschinen1 zu recyceln , 2. nach Internalisierung über Clathrin-abhängige oder -unabhängige Endozytose, Protein- und Lipid-Ladung zuerst früh bevölkern Endosomen aus, wo sie weitere sind entweder entlang der Endo-lysosomalen System recycelt, die Plasmamembran umgeleitet oder gezielt mit dem Trans-Golgi-Netzwerk (TGN). Recycling aus Endosomen und/oder der Zelloberfläche, die TGN ist Teil des funktionalen Zyklus einer Reihe von Anterograde transmembranen Fracht-Rezeptoren, wie z. B. die kationen-abhängige und kation-unabhängige Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren (CDMPR und CIMPR) liefern neu synthetisiert lysosomale Hydrolasen aus der TGN zu späten Endosomen und Lysosomen3,4,5, Sortilin und SorLA6,7und Wntless (WLS) Transport von Wnt-Liganden an die Zelloberfläche 8 , 9 , 10 , 11. andere Proteine, die zurück zu der TGN abgerufen werden TGN46 und seine Verwandten Isoformen12,13,14, SNAREs (lösliche N- Ethylmaleimide-Sensitive Fusion Faktor Anhaftung Rezeptoren) 15 , 16 , Amyloid-Precursor-Protein (APP)18,19, progressive Ankylose (ANK) Protein20, 17, Metal Transporter wie ATP7A/B oder DMT121,22, und transmembranen Verarbeitung von Enzymen einschließlich Carboxypeptidase D, Furin oder BACE123,24,25. Abgesehen von dieser körpereigene Proteine entführen Bakterien- und Pflanze Giftstoffe (z.B., Shiga und Cholera-Toxin Rizin und Ranker) retrograder Transport Maschinen, die ER für Retrotranslocation in der Zellflüssigkeit26,27zu erreichen, 28,29.
Um direkt retrograde Datenverkehr analysieren, haben wir zuvor entwickelt, eine gemeinnützige-basierte Toolkit zu beschriften und Ladung Proteine von der Zelloberfläche zum intrazellulären Kompartimenten30folgen. Nanobodies repräsentieren eine neue Familie von Protein-Bindemittel Homodimeric Heavy-Kette-nur Antikörper (HcAbs), die natürlicherweise in Kameliden und Cartilaginous Fische31,32abgeleitet. Sie bilden die Variable Heavy-Kette-Domäne (LHKW) der HcAbs und haben viele Vorteile gegenüber herkömmlichen Antikörper (z. B. IgGs): sie sind Monomere, klein (~ 15 kDa), sehr löslich, frei von Disulfid-Bindungen, bakteriell ausgedrückt werden können und für ausgewählte hohe Affinität verbindlichen33,34,35,36. Um unsere gemeinnützige Tool vielseitig und breit anwendbar zu machen, haben wir funktionalisierten Anti-GFP Nanobodies Oberfläche-Label und Track Proteinen getaggt mit GFP in ihrer extrazellulären/lumenal Domain beschäftigt. Durch Funktionalisierung der Nanobodies mit mCherry, Ascorbat-Peroxidase 2 (APEX2)37oder Tyrosin Sulfatierung (TS) Sequenzen, retrograder Transport von Bonafide transmembranen Ladung Proteine analysiert werden kann, indem Sie entweder behoben und live Cell Imaging, von Elektronenmikroskopie, oder biochemisch. Da Tyrosin Sulfatierung vermittelt durch Tyrosylprotein Sulfotransferasen (TPST1 und TPST2) eine posttranslationale Modifikation nur auf das Trans-Golgi ist/TGN, können wir direkt studieren, Transport und die Kinetik der Proteine des Interesses von der Zelloberfläche dazu intrazelluläre Golgi Fach38,39,40.
In diesem Artikel Methoden beschreiben wir die einfache Herstellung von funktionalisierten Nanobodies (LHKW-2xTS, - APEX2, - mCherry und Derivate) eignet sich für vielfältige Anwendungen, retrograden Transport in Säugerzellen30zu analysieren. Wir konzentrieren uns hauptsächlich auf die Verwendung von TS Standort geändert gemeinnützige für Analyse der intrazellulären Verkehr von der Zelloberfläche in das Fach der Sulfatierung.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transport von Proteinen und Membranen von der Zelloberfläche, die Golgi und darüber hinaus ist wichtig für die Homöostase, Organell Identität und Physiologie. Um die retrograde Protein Verkehr zu untersuchen, haben wir vor kurzem eine vielseitige gemeinnützige-basierte Toolkit zu analysieren, Transport von der Zelloberfläche, die Golgi-Komplex, entweder von festen und live Cell imaging, mittels Elektronenmikroskopie oder biochemisch entwickelt. Wir entwickelten funktionalisierten Anti-grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Nanobodies – klein, Monomere, hohe Affinität Protein Bindemittel – die auf Zell-Linien mit dem Ausdruck Membranproteine von Interesse mit einer extrazellulären GFP glyko-angewendet werden können. Derivatisierte Nanobodies verpflichtet, die GFP-Reporter sind speziell verinnerlicht und Huckepack Sortierung Routen die Reporter transportiert. Nanobodies wurden funktionalisiert mit Fluorophore zu folgen retrograden Transport durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Imaging mit Ascorbat-Peroxidase 2 (APEX2) zu untersuchen, die Ultrastrukturforschung Lokalisierung der Reporter-gemeinnützige komplexe von Elektron zu leben Mikroskopie und mit Tyrosin Sulfatierung (TS) Motive zur Kinetik der Trans-Golgi-Netzwerk (TGN) Ankunft zu beurteilen. In diesem methodischen Artikel erläutern wir das allgemeine Verfahren um bakteriell auszudrücken und funktionalisierten Nanobodies zu reinigen. Wir veranschaulichen die starke Verwendung von unserem Tool mit mCherry und TS geändert Nanobodies, endocytic Aufnahme und TGN Ankunft der Ladung Proteine zu analysieren.

Um retrograde Protein Transport zu verschiedenen intrazellulären Destinationen zu untersuchen, haben wir vor kurzem etabliert, ein Anti-GFP gemeinnützige-basiertes Tool zum Beschriften und rekombinanten Fusionsproteinen aus der Zelle Oberfläche30folgen. Hier zeigen wir die bakterielle Produktion solcher Nanobodies derivatisiert und demonstrieren ihre Anwendung endocytic Aufnahme durch Fluoreszenz-Mikroskopie sowie Immunoblotting und deren Einsatz zur TGN Ankunft...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse der Endocytic Aufnahme und retrograder Transport mit funktionalisierten Nanobodies in kultivierten Zellen mit dem Trans-Golgi-Netzwerk

Retrograder Transport von Proteinen von der Zelloberfläche an die Golgi unbedingt Membran Homöostase. Hier beschreiben wir eine Methode um biochemisch Zelle Oberfläche-Golgi Transport von rekombinanten Proteinen mit funktionalisierten Nanobodies in HeLa-Zellen zu analysieren.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Diese Methode ermöglicht die Produktion und Anwendung von bakteriellen, funktionalisierten Nanokörpern, um den retrograden Proteintransport von der Zelloberfläche in interzelluläre Kompartimente zu analysieren. Insbesondere das Trans-Golgi-Netz. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Verwendung von Sulfatierung. Eine hochspezifische, abgeschottete und sensible Post-Translation-Änderung zur Bewertung der Ankunft des Nano-Körper-Komplexes von Reportern im DTN-Fach. Diese Methode in Kombination mit anderen derivatisierten Nanokörpern für die Lebenszellbildgebung und Elektronenmikroskopie kann auch zur Untersuchung endocitischer Prozesse von krankheitsbedingten Zelloberflächenrezeptoren eingesetzt werden. Unser Repertoire an funktionalisierten Nanokörpern wurde entwickelt, um retrograde Transporte in kultivierten Zellen zu untersuchen. Diese Werkzeuge können jedoch auch in mehrzelligen Organismen angewendet werden. Um dieses Verfahren zu beginnen, wählen Sie eine Bakterienkolonie, die den Vektor von Interesse von der Platte enthält, und impfen Sie einen Kolben mit 20 Millilitern LB-Medium, das mit Antibiotika ergänzt wird. Inkubieren Über nachtbei 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Stickstoff-Kavitation und differentielle Zentrifugation ermöglicht eine Überwachung der Verteilung von peripheren Membranproteinen in kultivierten Zellen

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Forschung

Biochemie

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analysen der mitochondrialen Calcium Zustrom in isolierten Mitochondrien und kultivierten Zellen

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesen und DNA-Reparatur-Assay mit Einzel-Nukleotid-Erweiterung und MALDI-TOF Massenspektrometrie-Analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Dichtegradienten-Ultrazentrifugation zur Untersuchung des endozytären Recyclings in Säugetierzellen

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: Eine optimierte Anwendung für Protein-Co-Expressions-Clustering und Netzwerkanalyse in der Proteomik

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Routinemäßige Sammlung von hochauflösenden Kryo-EM-Datensätzen mit einem 200-KV-Transmissionselektronenmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extrazellulärer Glukosemangel als indirektes Maß für die Glukoseaufnahme in Zellen und Geweben ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...