Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי גרנט 31003A-162643 על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית. אנו מודים ניקול Beuret, את Biozentrum הדמיה הליבה מתקן (IMCF) לקבלת תמיכה.

1. חיידקי טרנספורמציה עם Functionalized Nanobodies
הערה: פרוטוקול זה הותאם עבור הביטוי, טיהור, ניתוח של nanobodies נגד functionalized-GFP כפי שתואר לעיל30. Derivatization עם moieties חלבונים אחרים עשויים לדרוש שינוי של הפרוטוקול הסטנדרטי.
<ol><li>להפשיר חיידקים chemocompetent (~ 100 µL) מתאים ביטוי חלב?...

Nanobodies מייצג את שיעור המתעוררים של חלבון פיגומים קלסר עם יתרונות רבים על פני נוגדנים קונבנציונלי: הם קטנים, יציבה, monomeric, ניתן לבחור עבור דיסולפידי זיקה וחוסר גבוהה אג ח33,35, 44 , 45. הם משמשים במספר יישומים, כגון מערכות התרבו?...

תנועה רטרוגרדית של חלבונים ושומנים מפני השטח תא אל תאי תאיים שונים הוא קריטי עבור תחזוקה של הומאוסטזיס ממברנה לאזן את הפרשה, למחזר מרכיבי anterograde תחבורה machineries1 , 2. בעקבות הפנמה דרך אנדוציטוזה clathrin תלוית או - עצמאית, חלבונים, שומנים בדם מטען קודם לאכלס מוקדם endosomes מהיכן שהם נמצאים רחוק הופנה גם לאורך מערכת אנדו-lysosomal, ממוחזר כדי קרום פלזמה, . או יישוב לרשת הטרנס-גולג'י (TGN). מיחזור endosomes ו/או על פני התא כדי TGN זה חלק מהמחזוריות פונקציונלי של מספר anterograde מטען transmembrane רצפטורים, כגון הקטיון תלוית ועצמאי הקטיון מנוז-6-פוספט הקולטנים (CDMPR ו- CIMPR) אספקת לאחרונה מסונתז hydrolases lysosomal מ TGN endosomes מאחר lysosomes3,4,5, sortilin,6,SorLA7ושל Wntless (WLS) הובלת ונ ט ליגנדים השטח תא 8 , 9 , 10 , 11. לחלבונים אחרים לאחזר לחזור TGN TGN46 הינם שלו קשורים איזופורמים12,13,14, מלכודות (מסיס N- ethylmaleimide רגיש פיוז'ן גורם מצורף קולטנים) 15 , 16 , 17, קודמן עמילואיד חלבון (APP)18,19, ankylosis מתקדמת (תודה) חלבון20, מובילי מתכת כגון ATP7A/B או DMT121,22, ו transmembrane עיבוד אנזימים כולל קרבוקסיפפטידאז D, furin או BACE123,24,25. מלבד אלה חלבונים אנדוגני, רעלים בקטריאלי, צמח (למשל, טוקסין שיגה, כולרה, ריצין ו abrin) לחטוף machineries רטרוגרדית תחבורה כדי להגיע לחדר מיון לשם retrotranslocation לתוך ציטוזול26,27, 28,29.
על מנת לנתח ישירות רטרוגרדית התנועה, קודם לכן פיתחנו ערכת כלים מבוססי nanobody תווית ולעקוב אחר מטענים חלבונים מהמשטח תא תאיים תאים30. Nanobodies לייצג משפחה חדשה של קלסרים חלבון נגזר homodimeric כבד שרשרת-בלבד נוגדנים (hcAbs) המתרחשים באופן טבעי31,של גמליים ודגים סחוס-32. הם מהווים תחום שרשרת כבדה (VHH) משתנה של hcAbs ויש להם יתרונות רבים קונבנציונאלי נוגדנים (למשל, IgGs): הם monomeric, קטן (~ 15 kDa), מסיס מאוד, ללא, אגרות דיסולפידי יכול להיות מבוטא bacterially, ונבחר גבוהה-זיקה מחייבת33,34,35,36. כדי להפוך את כלי nanobody שלנו רב-תכליתי וישימים בקנה מידה נרחב, אנחנו מועסקים nanobodies נגד functionalized-GFP חלבונים פני תווית ולעקוב המתויגת GFP שלהם בתחום חוץ-תאית/lumenal. על ידי functionalization של nanobodies עם mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2) תחבורה רטרוגרדית37, או טירוזין sulfation (TS) רצפים, בוטרפליי מטען transmembrane חלבונים ניתן לנתח הכתיב קבוע ולחיות הדמיה תא, על-ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. מאז sulfation טירוזין מתווכת על-ידי sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 ו- TPST2) הוא שינוי posttranslational מוגבלת של הטרנס-גולג'י/TGN, ישירות שלומדים תחבורה, קינטיקה של חלבונים עניין מהמשטח התא הזה תאיים גולג'י תא38,39,40.
במאמר שיטות, נתאר את הקלות של ייצור של nanobodies functionalized (VHH-2xTS-APEX2, - mCherry נגזרים) מתאים עבור מספר יישומים כדי לנתח תחבורה רטרוגרדית תאים בתרבית של30. אנו מתמקדים בעיקר על השימוש של TS באתר-השתנה nanobody עבור ניתוח של התעבורה תאיים מהמשטח תא התא של sulfation.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

הובלה של חלבונים וממברנות מהמשטח תא גולג'י ומעבר חיוני הומאוסטזיס, זהות אברון, פיזיולוגיה. ללמוד תנועה רטרוגרדית חלבון, לאחרונה פיתחנו ערכת כלים מגוונים מבוססי nanobody לנתח תחבורה מהמשטח תא למתחם גולג'י, או על ידי תא קבוע ולחיות הדמיה, באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, או מבחינה ביוכימית. אנחנו מהונדסים חלבון פלואורסצנטי ירוק אנטי functionalized (GFP) nanobodies — חלבון קטן, monomeric, גבוהה-זיקה קלסרים — כי ניתן להחיל על שורות תאים לבטא קרום חלבונים עניין עם moiety-GFP חוץ-תאית. Nanobodies derivatized קשור הכתבים GFP במיוחד הם הפנימו והועברו קמח לאורך נתיבי המיון של הכתבים. Nanobodies היו functionalized עם fluorophores בצע תחבורה רטרוגרדית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ ולחיות הדמיה, עם ascorbate peroxidase 2 (APEX2) לחקור לוקליזציה ultrastructural של מתחמי כתב-nanobody על ידי אלקטרון מיקרוסקופ, ועם טירוזין מוטיבים sulfation (TS) כדי להעריך קינטיקה של טרנס-גולג'י רשת (TGN) הגעה. במאמר מתודולוגי, אנחנו חלוקה לרמות ההליך כללי bacterially אקספרס ולטהר functionalized nanobodies. אנו מדגימים את השימוש כלי שלנו באמצעות את nanobodies mCherry - ו TS-השתנה כדי לנתח ספיגת endocytic ואת ההגעה TGN של חלבונים מטען רב עוצמה.

לחקור חלבונים רטרוגרדית תחבורה ליעדים תאיים שונים, הקמנו לאחרונה כלי מבוסס-nanobody anti-GFP כדי תווית ובצע פיוז'ן רקומביננטי חלבונים מן השטח תא30. . הנה, נדגים לייצור חיידקים כגון derivatized nanobodies ומדגימים את היישום שלהם ללמוד ספיגת endocytic על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרו?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

ניתוח של ספיגת Endocytic ותעבורה רטרוגרדית לרשת הטרנס-גולג'י באמצעות Functionalized Nanobodies בתאים בתרבית

העברת רטרוגרדית חלבונים מהמשטח תא גולג'י הוא חיוני כדי לשמור על הומאוסטזיס ממברנה. כאן, אנו מתארים שיטה לנתח מבחינה ביוכימית תא השטח-כדי-גולג'י הובלה של חומרים באמצעות functionalized nanobodies בתאים הלה.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

שיטה זו מאפשרת ייצור ויישום של חיידקים מבוטאים, ננו-גופים פונקציונליים לנתח הובלת חלבון מדרדר מפני השטח של התא לתאים בין תאיים. במיוחד רשת טרנס-גולגי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא השימוש בגופרית. שינוי ספציפי מאוד, ממודר ורגיש לאחר התרגום כדי להעריך את הגעתו המורכבת של הכתב ננו-גוף לתא DTN. שיטה זו בשילוב עם ננו-גופים נגזרים אחרים להדמיית תאי חיים ומיקרוסקופיית אלקטרונים יכולה לשמש גם לחקר תהליכים אנדוציטיים של קולטני פני תאים הקשורים למחלות. הרפרטואר שלנו של ננו-גופים פונקציונליים תוכנן לחקור תחבורה מדרדרת בתאים מתורבתים. עם זאת, כלים אלה עשויים להיות מיושמים גם באורגניזמים רב תאיים. כדי להתחיל בהליך זה, לבחור מושבה חיידקית המכילה את הווקטור של עניין מהצלחת לחסן בקבוק המכיל 20 מיליליטר של בינוני LB בתוספת אנטיביוטיקה. דגירה לילה בגיל 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

קוויטציה חנקן, צנטריפוגה דיפרנציאלית מאפשר ניטור ההתפלגות של חלבוני ממברנה פריפריאלי בתאים בתרבית

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

הגהה ואת וזמינותו תיקון ה-DNA באמצעות ניתוח ספקטרומטר מסה MALDI-TOF והסיומת נוקלאוטיד יחיד

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

צפיפות הדרגתית אולטרה-מרכזית לחקירת מיחזור אנדוציטי בתאי יונקים

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: יישום יעיל עבור אשכולות ביטוי משותף של חלבונים וניתוח רשת בפרוטאומיקה

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

דלדול גלוקוז חוץ-תאי כמדד עקיף לספיגת גלוקוז בתאים וברקמות Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...