Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
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この作品は、スイスの全米科学財団による助成金 31003A 162643 によって支えられました。ニコール Beuret とサポート Biozentrum イメージング コア施設 (IMCF) に感謝します

1. 細菌変換機能 Nanobodies
注:このプロトコルは、前述の30式、浄化、機能性抗 GFP nanobodies の解析に最適化されています。他の蛋白質の鎖誘導体化は、この標準的なプロトコルの変更を必要があります。
<ol><li>蛋白質の表現に適しています chemocompetent 細菌 (~ 100 μ L) を解凍 (例えば、エシェリヒア属大腸菌ロゼッタ BL21 (DE3) 細胞) 氷の上...

Nanobodies は、従来の抗体に比べて多くの利点を持つタンパク質バインダー足場の新たなクラスを表す: 彼らは小さく、安定した、単量体、高親和性と不足のジスルフィド結合33,35,のために選択できます。44,45細胞培養システムと生物発生生物学46,47,</s...

タンパク質や細胞表面からさまざまな細胞内コンパートメントに脂質の逆行のトラフィックは分泌を相殺して前向性輸送機械1のコンポーネントを再利用する膜の恒常性の維持のために重要,2内面化クラスリン依存または独立したエンドサイトーシスを介して、以下貨物蛋白質と脂質を設定初期エンドソームからさらには細胞膜にリサイクル、遠藤ライソゾーム システムに沿っていずれかをリダイレクト。または、トランスゴルジ ネットワーク (TGN) にターゲットを絞った。前向性膜貫通貨物受容体、カチオン依存性および陽イオンに依存しないマンノース-6-リン酸受容体 (CDMPR ・ CIMPR) などの多数の機能サイクルの一部である、TGN にエンドソームや細胞表面からリサイクルを提供します。後期エンドソーム、リソソーム3,4、5ソーティリンと SorLA6、7トランスゴルジ (WLS) 細胞表面に Wnt リガンドを輸送、TGN からライソゾーム加水分解酵素を合成しました。8,9,10,11.、TGN に戻るを取得する他の蛋白質は TGN46 とその関連アイソ フォーム12,13,14スネア (可溶性Nエチルマレイミド感受性融合因子添付ファイル受容体)15,16,17、アミロイド前駆体タンパク質 (APP)18,19、進歩的な強直 (アンク) 蛋白質20、金属トランスポーター ATP7A/B または DMT121,22, などと膜貫通酵素カルボキシペプチダーゼ D、風鈴 BACE123,24,25などを処理します。これらの内因性のタンパク質から離れて細菌植物毒素 (例えば、滋賀とコレラ毒素、リシン、アブリン) ハイジャックに細胞質26,27、retrotranslocation の小胞体に到達する逆行輸送機械 28,29。
逆行性のトラフィックを直接分析するために以前にラベルを貨物蛋白質を細胞表層から細胞内コンパートメント30に従ってください生物学: ナノボディでベースのツールキットを開発しました。Nanobodies は、タンパク質バインダー量重鎖だけ抗体 (hcAbs) ラクダ科動物、軟骨魚類の31,32で発生する自然由来の新しいファミリを表します。HcAbs の変数の重鎖のドメイン (VHH) を構成し、従来の抗体 (Igg など) に比べて多くの利点がある: 彼らは単量体、小さな (~ 15 kDa)、非常に溶ける、二硫化物結束を欠いている細菌によって表される、選択することができます高親和性結合33,34,35,36。私たちの生物学: ナノボディでツールをするためには、汎用性と広く適用/内腔細胞外ドメインに GFP が付いた表面ラベルとトラックのタンパク質機能抗 GFP nanobodies を採用しました。(APEX2) アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 mCherry と nanobodies の機能化によって真正な貨物の膜貫通タンパク質の37、またはチロシン硫酸化 (TS) シーケンスの逆行輸送どちらか固定で分析することができますなど、ライブセル イメージングで電子顕微鏡検査、または生化学的。チロシン硫酸化チロシン硫酸化硫酸転移酵素 (TPST1 および TPST2) で媒介はトランス Golgi に制限修飾 TGN、直接勉強できるトランスポートおよびこれに細胞表層の興味の蛋白質の動態/細胞ゴルジ区画38,39,40。
この方法の記事で哺乳類セル30における逆行性輸送を分析するアプリケーションの数に適した機能性 nanobodies (VHH 2xTS、- APEX2、- mCherry 誘導体) の生産の容易さについて述べる。我々 は主に硫酸化のコンパートメントに細胞表層から細胞内トラフィックの分析のための TS サイト変更生物学: ナノボディでの使用に焦点を当てます。

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

タンパク質とゴルジ体内外細胞表面膜の輸送は、恒常性、細胞小器官アイデンティティおよび生理学に不可欠です。逆行性プロテイン トラフィックを研究、細胞表面から固定しライブの細胞イメージング、電子顕微鏡検査、または生化学的、ゴルジ複合体への輸送を分析するための多彩な生物学: ナノボディでベースのツールキットを最近開発しました。我々 設計機能抗緑の蛍光蛋白質 (GFP) nanobodies-小さな、単量体、高親和性タンパク質バインダー-細胞外の GFP 部分と利子の膜蛋白質を表現する細胞へ適用することができます。GFP レポーターにバインドし誘導体化 nanobodies 具体的に内在化されているし、記者の並べ替えルートに沿ってピギーバック輸送。Nanobodies 蛍光顕微鏡による逆行性輸送に従うとライブ イメージング、アスコルビン酸ペルオキシダーゼ 2 電子記者生物学: ナノボディで複合体の電顕的局在を調べる (APEX2) fluorophores が付いている修飾されました。顕微鏡とトランスゴルジ ネットワーク (TGN) 到着の動態を評価するためにチロシン硫酸化 (TS) をモチーフにしました。この方法論の記事で細菌によって表現し、機能性 nanobodies を浄化する一般的な手順の概要を説明します。取り込みや TGN 到着貨物蛋白質を分析する mCherry と TS 変更 nanobodies を使用して私たちのツールの強力な使用をについて説明します。

様々 な細胞内の目的地への逆行性蛋白輸送を調べるためには、ラベルを付けると、セル表面30から組換え融合蛋白質に従ってください抗 GFP 生物学: ナノボディでベースのツールを開設します。ここでは、このような細菌の生産 nanobodies 誘導体し、硫酸化解析による TGN 到着を調査する彼らの使用と同様、蛍光顕微鏡と免疫ブロット、取り込みを研究?...

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

取り込みと培養細胞における機能性 Nanobodies を用いたトランスゴルジ ネットワークへの逆行性輸送の解析

ゴルジ体細胞表面からタンパク質の逆行輸送は膜の恒常性を維持するために不可欠です。ここでは、HeLa 細胞における機能性 nanobodies を用いた組換えタンパク質の細胞表面にゴルジ体輸送を生化学的解析法について述べる。

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

この方法により、細菌発現、機能化されたナノボディの生産と応用が可能になり、細胞表面から細胞間区画への逆行タンパク質輸送を解析することができます。特にトランスゴルジネットワーク。この技術の主な利点は、硫酸化の使用である。DTNコンパートメントでのレポーターナノボディ複合体の到着を評価するための、高度に特異的で、区分化された、敏感な翻訳後の変更。この方法は、生命細胞イメージングおよび電子顕微鏡のための他の誘導体ナノボディと組み合わせて、疾患関連細胞表面受容体のエンドサイトプロセスを研究するためにも使用することができる。機能化されたナノボディのレパートリーは、培養細胞における逆行輸送を研究するために設計されています。しかし、これらのツールは多細胞生物にも適用され得る。この手順を開始するには、プレートから目的のベクターを含む細菌コロニーを選び、抗生物質を添加したLB培地20ミリリットルを含むフラスコを接種する。37で一晩インキュベート

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