Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

이 작품은 그랜트 31003A-162643 스위스 국립 과학 재단에 의해 지원 되었다. 우리 니콜 Beuret는 Biozentrum 이미징 핵심 시설 (IMCF) 지원에 대 한 감사합니다.

1. 세균성 전이 기능성된 Nanobodies
참고: 이 프로토콜은 앞에서 설명한30식, 정화, 고 기능성된 안티-GFP nanobodies의 분석에 대 한 최적화 되었습니다. 다른 단백질 moieties와 derivatization이 표준 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다.
<ol><li>해 동 chemocompetent 박테리아 (~ 100 µ L) 단백질 표정에 적합 (예를 들면, 대장균 로제타 BL21 (DE3) 셀) 얼음에...

Nanobodies 많은 이점이 기존의 항 체와 단백질 바인더 장비의 신흥 클래스 대표: 그들은 작은, 안정, 단위체, 높은 친 화력과 부족 이황화 채권33,35, 에 선정 될 수 있다 44 , 45. 세포 배양 시스템에 유기 체 개발 생물학46,47,48,<s...

단백질과 지질 세포 표면에서 다양 한 세포내 구획을의 역행 트래픽이 막 항상성 분 비를 균형 잡히게 하 고 참가자 전송 기계1 의 구성 요소를 재활용의 유지 보수에 대 한 중요 한 , 2. 다음 clathrin-또는-독립적인 endocytosis 통해 국제화, 단백질 및 지질 화물은 먼저 일찍 채울 endosomes 어디에서 그들은 더 중 엔 lysosomal 시스템, 플라즈마 막에 재활용 따라 리디렉션 또는 trans Golgi 네트워크 (TGN) 대상. 다양 한 양이온 종속 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CDMPR 및 CIMPR) 등 참가자 막 횡단 화물 수용 체의 기능 사이클의 일부인는 TGN endosomes 및 셀 표면에서 재활용 제공 새로 합성 늦은 endosomes와 리소좀3,,45, sortilin 및 SorLA6,7, 및 Wntless (WLS) 수송 하는 세포 표면에 Wnt ligands는 TGN에서 lysosomal hydrolases 8 , 9 , 10 , 11. 다시는 TGN에 검색 하는 다른 단백질은 TGN46 및 그것의 관련된 isoforms12,13,14, SNAREs (수용 성 N-ethylmaleimide-민감한 퓨전 요소 첨부 수용 체) 15 , 16 , 17, 녹말 체 선구자 단백질 (APP)18,19, 진보적인 ankylosis (ANK) 단백질20, ATP7A/B 나 DMT121,22, 등 고 막 횡단 금속 전송기 효소 carboxypeptidase D, furin 또는 BACE123,,2425를 포함 하 여 처리. 이러한 내 생 단백질은 그렇다 하 고 박테리아 및 식물 독 소 (예를 들어, 시가 콜레라 독 소, 신은 abrin) 납치 cytosol26,27,에 retrotranslocation에 대 한 응급실에 도달 역행 수송 기계 , 2829.
직접 역행 트래픽 분석, 위해 이전 레이블 및 세포내 구획30화물 단백질을 세포 표면에서 따라 하는 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. Nanobodies는 homodimeric 무거운 체인만 항 체 (hcAbs) camelids과 연골 물고기31,32에서 자연스럽 게 발생 하는에서 파생 된 단백질 바인더의 새로운 가족을 나타냅니다. 그들은 hcAbs의 변수 중 체인 도메인 (VHH)를 구성 하 고 기존의 항 체 (예: IgGs)에 비해 많은 장점이 있다: 그들은 단위체, 작은 (~ 15 kDa), 높은 가용성, 이황화 결합, 없는 bacterially 표현 하 고 선정 수 높은 친 화력 바인딩33,,3435,36. 우리의 nanobody 도구를 다양 하 고 광범위 하 게 적용을 하려면 우리는 표면 레이블과 트랙 단백질 그들의 세포 외/lumenal 도메인에서 GFP 태그로 기능성된 안티-GFP nanobodies 고용. MCherry, 하는데 과산화 효소 2와 nanobodies (APEX2)의 기능화에 의해37또는 티로신 sulfation (TS) 시퀀스, 역행 bonafide 막 횡단 화물 단백질의 고정으로 분석 될 수 있다 수송과 라이브 셀 이미징 전자 현미경 검사 법, 또는 화학적. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 및 TPST2)에 의해 중재 티로신 sulfation 이기 때문에 trans Golgi 제한 posttranslational 수정/TGN, 우리 수 있다 직접 전송 하 고이 셀 표면에서 관심사의 단백질의 활동 세포내 Golgi 구획38,,3940.
이 방법 문서에서는, 우리는 포유류 세포30의 역행 교통 분석 응용 프로그램의 수에 적합 한 기능성된 nanobodies (VHH-2xTS,-APEX2,-mCherry 및 파생 상품)의 생산의 용이성을 설명 합니다. 우리는 주로 sulfation의 세포 표면에서 세포내 매매의 분석에 대 한 TS 사이트 수정 nanobody의 사용에 초점.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

수송 단백질은 골을 넘어 셀 표면에서 막의 항상성, 세포 기관이 정체성과 생리학에 대 한 필수적입니다. 공부 하 고 퇴행 성 단백질 트래픽, 최근 고정 및 라이브 셀 이미징, 전자 현미경, 또는 화학적 여 골 복잡 한 세포 표면에서 수송 분석을 다양 한 nanobody 기반 툴킷을 개발 했습니다. 우리 설계 기능성된 안티 녹색 형광 단백질 (GFP) nanobodies-작고, 단위체, 높은 선호도 단백질 바인더-셀 라인 막 단백질 extracellular GFP moiety와 관심의 표현에 적용 될 수 있는. Derivatized nanobodies GFP 기자에 바인딩된 특별히 내 면 고 기자 정렬 경로 따라 피기백을 수송. Nanobodies은 기능성을 형광 현미경 검사 법에 의해 역행 수송을 따라 하는데 과산화 효소 2 전자에 의해 기자 nanobody 복합물의 ultrastructural 지역화를 조사 (APEX2)와 영상 살 fluorophores와 현미경 검사 법, 그리고 trans Golgi 네트워크 (TGN) 도착의 활동을 평가 하기 위해 티로신 sulfation (TS) 모티브. 이 방법론 문서에서는, 우리는 bacterially 표현 하 고 기능성된 nanobodies 정화 일반 절차 개요. 우리는 mCherry 및 TS 수정 nanobodies endocytic 통풍 관 및 TGN 도착 화물 단백질의 분석을 사용 하 여 우리의 도구를 사용 하 여를 강력한를 보여줍니다.

다양 한 세포내 목적지 역행 단백질 교통 조사, 우리는 최근 레이블 및 셀 표면30에서 재조합 융합 단백질을 따라 하는 안티-GFP nanobody 기반 도구를 설립 했습니다. 여기, 그러한 세균 생산 nanobodies derivatized 그리고 TGN 도착 sulfation 분석 조사를 그들의 사용 뿐만 아니라 형광 현미경 검사 법 및 immunoblotting, endocytic 통풍 관 공부를 그들의 응용 프로그램을 보?...

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

배양된 세포에서 기능성된 Nanobodies를 사용 하 여 Trans Golgi 네트워크 Endocytic 통풍 관 및 역행의 분석

Golgi 세포 표면에서 단백질의 역행 수송 막 항상성 유지에 필수적 이다. 여기, 우리는 화학적 HeLa 세포에서 기능성된 nanobodies를 사용 하 여 재조합 단백질의 세포 표면에 골 교통을 분석 하는 방법을 설명 합니다.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

이 방법은 세균발현, 기능성 나노 바디의 생산 및 적용을 가능하게 하여 세포 표면에서 세포 간 구획으로 의 역행단백질 수송을 분석할 수 있다. 특히 트랜스 골기 네트워크. 이 기술의 주요 장점은 황양의 사용입니다. DTN 구획에 기자 나노 바디 복합 도착을 평가하기 위해 매우 구체적이고 구획화되고 민감한 번역 후 수정. 생명 세포 이미징 및 전자 현미경 검사법을 위한 다른 파생된 나노 바디와 병용이 방법은 또한 질병 관련 세포 표면 수용체의 내막 과정을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 기능성 나노 바디의 우리의 레퍼토리는 배양된 세포에 있는 역행 수송을 공부하기 위하여 디자인되었습니다. 그러나, 이러한 도구는 또한 다세포 유기체에서 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시작하려면, 플레이트에서 관심의 벡터를 포함하는 세균 성 식민지를 선택하고 항생제로 보충 된 LB 배지의 20 밀리리터를 포함하는 플라스크를 접종. 37에서 하룻밤 인큐베이션

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질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

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연구

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고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

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