Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Grant 31003A-162643 av Swiss National Science Foundation. Vi takker Nicole Beuret og den Biozentrum Imaging Core anlegg (IMCF) for støtte.

1. bakteriell transformasjon med Functionalized Nanobodies
Merk: Denne protokollen er optimalisert for uttrykket, rensing og analyse av functionalized anti-GFP nanobodies som beskrevet tidligere30. Derivatization med andre protein moieties kreve endring av denne standardprotokollen.
<ol><li>Tine chemocompetent bakterier (~ 100 µL) egnet for protein uttrykk (f.eks Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) celler) ved å plassere dem på isen. <s...

Nanobodies representerer en ny klasse av protein dokumentordner stillaser med mange fordeler fremfor konvensjonelle antistoffer: de er små, stabil, monomerisk, kan velges for høy affinitet og mangel disulfide obligasjoner33,35, 44 , 45. de brukes i en rekke programmer, slik som i celle kultur systemer og organismer utviklingsbiologi46,47</s...

Retrograd trafikk proteiner og lipider fra celleoverflaten til ulike intracellulær rom er avgjørende for vedlikehold av membran homeostase motvekt sekresjon og resirkulere komponenter i anterograd transport machineries1 , 2. etter internalisering via clathrin-avhengige eller -uavhengig endocytose, protein og lipid Last først fylle tidlig endosomes fra der de er ytterligere Omdirigert enten langs endo-lysosomale systemet, resirkulert til plasma membranen, eller målrettet trans-Golgi nettverket (TGN). Resirkulering fra endosomes og/eller celleoverflaten til TGN er en del av funksjonelle syklusen av en rekke anterograd transmembrane Last reseptorer, som kasjon-avhengig og uavhengig av cation mannose-6-fosfat receptors (CDMPR og CIMPR) levere nylig syntetisert lysosomale hydrolases fra TGN sent endosomes og lysosomer3,4,5, sortilin og SorLA6,7og Wntless (WLS) transport Wnt ligander til celleoverflaten 8 , 9 , 10 , 11. andre proteiner hentet tilbake til TGN er TGN46 og dens relaterte isoformene12,13,14, snarer (løselig N- ethylmaleimide-sensitive fusion faktor vedlegg reseptorer) 15 , 16 , 17, amyloid forløper protein (APP)18,19, progressiv ankylosis (ANK) protein20, metall transportører som ATP7A/B eller DMT121,22, og transmembrane behandler enzymer inkludert karboksypeptidase D, furin eller BACE123,24,25. Bortsett fra disse endogene proteiner kapre bakteriell og plante giftstoffer (f.eks Shiga og kolera gift, Risin og abrin) retrograd transport machineries å nå ER for retrotranslocation i stoffer26,27, 28,29.
For å direkte analysere retrograd trafikk, har vi utviklet et nanobody-baserte verktøysett for å merke og følg Last proteiner fra celleoverflaten til intracellulær rom30. Nanobodies representerer en ny familie av protein bindemidler avledet fra homodimeric tunge-kjede-bare antistoffer (hcAbs) som naturlig oppstår i camelids og cartilaginous fisker31,32. De utgjør variabel tunge-kjeden domenet (VHH) av hcAbs og har mange fordeler fremfor konvensjonelle antistoffer (f.eks IgGs): de er monomerisk, liten (~ 15 kDa) svært løselig, uten disulfide obligasjoner, kan bacterially uttrykt og valgt for høy affinitet bindende33,34,35,36. For å gjøre våre nanobody verktøyet allsidig og bredt aktuelt, ansatt vi functionalized anti-GFP nanobodies overflaten-etikett og spore proteiner merket med GFP på deres ekstracellulære/lumenal domene. Ved functionalization av nanobodies med mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfation (TS) sekvenser, retrograd transport av bonafide transmembrane Last proteiner kan analyseres av enten fast og lever celle bildebehandling, av elektronmikroskop, eller biokjemisk. Siden tyrosin sulfation formidlet av tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 og TPST2) er en posttranslational endring begrenset til trans-Golgi/TGN, kan vi direkte studere transport og kinetics proteiner av interesse fra celleoverflaten til dette intracellulær Golgi kupé38,39,40.
I denne metoder artikkelen beskriver vi enkel produksjon av functionalized nanobodies (VHH-2xTS-APEX2, - mCherry og derivater) egnet for en rekke programmer til å analysere retrograd transport i pattedyrceller30. We fokusere hovedsakelig på bruk av TS området endret nanobody for analyse av intracellulær trafikk fra celleoverflaten sulfation-rommet.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transport av proteiner og membraner fra celleoverflaten av Golgi og utover er nødvendig for homeostase, organelle identitet og fysiologi. For å studere retrograd protein trafikk, har vi nylig utviklet en allsidig nanobody-baserte verktøykasse for å analysere fra celleoverflaten transport til Golgi komplekset, enten ved faste og levende celle imaging elektronmikroskop, eller biokjemisk. Vi utviklet functionalized anti-grønn fluorescerende protein (GFP) nanobodies-liten, monomerisk, høy affinitet protein bindemidler, som kan brukes på linjer uttrykke membran proteiner av interesse med en ekstracellulære GFP moiety. Derivatized nanobodies bundet til GFP journalister er spesielt internalisert og transportert piggyback langs journalister sortering ruter. Nanobodies var functionalized med fluorophores å følge retrograd transport av fluorescens mikroskopi og live bildebehandling, med ascorbate peroxidase 2 (APEX2) for å undersøke den ultrastructural lokaliseringen av reporter-nanobody komplekser av elektron mikroskopi, og med tyrosin sulfation (TS) motiver å vurdere kinetics trans-Golgi nettverk (TGN) ankomst. I denne metodologiske artikkelen skissere vi de generelle fremgangsmåten for å bacterially express og rense functionalized nanobodies. Vi illustrerer kraftig bruk av våre verktøy bruker mCherry - og TS-endret nanobodies å analysere endocytic opptak og TGN ankomsten av Last proteiner.

Undersøke retrograd protein transport til ulike intracellulær destinasjoner, har vi nylig etablert en anti-GFP nanobody-basert verktøy for å merke og følg rekombinant fusion proteiner fra cellen overflaten30. Her viser vi bakteriell produksjonen av slike derivatized nanobodies og demonstrere programmet å studere endocytic opptak av fluorescens mikroskopi og immunoblotting, i tillegg til deres bruk å undersøke TGN ankomst av sulfation analyse. Sistnevnte pro...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analyse av Endocytic opptak og retrograd Transport til Trans-Golgi nettverket med Functionalized Nanobodies i kulturperler celler

Retrograd transport av proteiner fra celleoverflaten til Golgi er avgjørende for å opprettholde membran homeostase. Her beskriver vi en metode for å analysere biokjemisk cellen overflaten til Golgi transport av rekombinante proteinene bruke functionalized nanobodies i HeLa celler.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Denne metoden gjør det mulig for produksjon og anvendelse av bakterielle uttrykte, funksjonaliserte nanolegemer å analysere retrograd proteintransport fra celleoverflaten til intercellulære rom. Spesielt Trans-Golgi-nettverket. Den største fordelen med denne teknikken er bruken av sulfatasjon. En svært spesifikk, compartmentalized, og følsom post-oversettelse modifikasjon for å vurdere reporter nano-kroppen kompleks ankomst i DTN-rommet. Denne metoden i kombinasjon med andre derivatiserte nanolegemer for livscelleavbildning og elektronmikroskopi kan også brukes til å studere endokitiske prosesser av sykdomsrelaterte celleoverflatereseptorer. Vårt repertoar av funksjonaliserte nanolegemer har blitt utviklet for å studere retrogradtransport i kultiverte celler. Imidlertid kan disse verktøyene også brukes i flercellede organismer. For å begynne denne prosedyren, velg en bakteriell koloni som inneholder vektoren av interesse fra platen og inokulerer en kolbe som inneholder 20 milliliter LB medium supplert med antibiotika. Inkuber over natten kl 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Nitrogen kavitasjon og differensial sentrifugering tillater overvåking fordelingen av ytre membran proteiner i kulturperler celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalsium tilstrømning av isolerte mitokondrier og kultivert celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturlesing og DNA reparasjon analysen Single nukleotid forlengelse og MALDI-TOF massespektrometri analyse

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Tetthet gradient ultracentrifugation for å undersøke endokytisk resirkulering i pattedyrceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPN: En strømlinjeformet applikasjon for klynger med proteinkouttrykk og nettverksanalyse i proteomikk

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinemessig innsamling av kryo-EM-datasett med høy oppløsning ved bruk av 200 KV-transmisjonselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ekstracellulær glukoseuttømming som et indirekte mål på glukoseopptak i celler og vev ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...