Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por Grant 31003A-162643 pela Fundação de ciência nacional suíço. Agradecemos a Nicole Beuret e o Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pelo apoio.

1. bacteriana transformação com funcionalizados Nanobodies
Nota: Este protocolo foi otimizado para a expressão, purificação e análise de nanobodies anti-GFP funcionalizados como descrito anteriormente,30. Derivatização com outras partes da proteína pode requerer a modificação do presente protocolo padrão.
<ol><li>Descongelar as bactérias chemocompetent (~ 100 µ l) adequadas para a expressão da proteína (por exemplo, Escherichia col...

Nanobodies representam uma classe emergente de andaimes de proteína ligante com muitas vantagens sobre anticorpos convencionais: eles são pequenos, estável, monomérico, podem ser selecionados para alta afinidade e falta dissulfeto títulos33,35, 44 , 45. são usados em muitas aplicações, tais como nos sistemas de cultura de células e organismos em biologia do desenvolvimento<sup class="x...

Trânsito retrógrado de proteínas e lipídios de superfície celular para vários compartimentos intracelulares é crucial para a manutenção da homeostase de membrana para contrabalançar a secreção e reciclar componentes de anterógrada transporte machineries1 , 2. após internalização através de endocitose dependente de Clatrina ou - independente, carga de proteínas e lipídios primeiro preencher cedo endossomos de onde eles são mais Redirecionado ou ao longo do sistema endo-lisossomal, reciclado para a membrana plasmática, ou direcionados à rede trans-Golgi (TGN). Reciclagem de endossomos e/ou a superfície da célula para o TGN é parte do ciclo funcional de um número de receptores de carga do transmembrane anterógrada, tais como os receptores de manose-6-fosfato de cação-dependente e independente de cátion (CDMPR e CIMPR) entregando recém sintetizado hidrolases lisossômicas do TGN para tarde endossomos lisossomos3,4,5, sortilin e SorLA6,7e Wntless (WLS) transportando Wnt ligantes à superfície da célula 8 , 9 , 10 , 11. outras proteínas obtidas para o TGN são TGN46 e suas isoformas relacionados12,13,14, SNAREs (solúvel em N- proteÃ sensíveis à fusão fator acessório receptores) 15 , 16 , 17, precursora amiloide (APP) de proteína18,19, anquilose progressiva (ANK) proteína20transportadores metálicos tais como ATP7A/B ou DMT121,22e do transmembrane processamento de enzimas, incluindo a carboxipeptidase D, furina ou BACE123,24,25. Para além destas proteínas endógenas, toxinas bacterianas e vegetais (por exemplo, toxina Shiga e cólera, ricina e abrin) sequestrar máquinas de transporte retrógrado para alcançar a ER para retrotranslocation para o citosol26,27, 28,29.
A fim de analisar diretamente trânsito retrógrado, anteriormente desenvolvemos um conjunto de ferramentas baseadas em nanobody para rotular e siga proteínas de carga de superfície celular para compartimentos intracelulares30. Nanobodies representam uma nova família de proteínas ligantes derivados de homodimeric cadeia pesada-somente anticorpos (hcAbs) que ocorrem naturalmente em camelídeos e peixes cartilagíneos31,32. Eles constituem o domínio variável de cadeia pesada (VHH) de hcAbs e têm muitas vantagens sobre anticorpos convencionais (por exemplo, IgGs): eles são monoméricos, pequeno (~ 15 kDa), altamente solúvel, desprovida de ligações de bissulfeto, pode ser bacteriana expressos e selecionado para ligação de alta afinidade33,34,35,36. Para tornar a nossa ferramenta de nanobody versátil e amplamente aplicável, utilizamos funcionalizados anti-GFP nanobodies às proteínas de superfície-rótulo e faixa com GFP no seu domínio extracelular/lumenal. Por functionalization de nanobodies com mCherry, peroxidase de ascorbato 2 (APEX2)37, ou sequências de sulfatação (TS) de tirosina, transporte retrógrado de proteínas transmembranares carga de bonafide pode ser analisado por qualquer fixo e vive de imagem latente da pilha, por microscopia eletrônica de varredura, ou bioquimicamente. Desde sulfatação tirosina mediada por sulfotransferases tyrosylprotein (TPST1 e TPST2) é uma modificação pós-traducional restringida para o trans-Golgi/TGN, podemos diretamente estudar transporte e cinética de proteínas de interesse da superfície da pilha para isso intracelulares Golgi compartimento38,39,40.
Neste artigo de métodos, descrevemos a facilidade de produção de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry e derivados) adequado para uma série de aplicativos para analisar o transporte retrógrado em células de mamíferos,30. Focamos principalmente o uso de TS site-modificado nanobody para análise de tráfego intracelular de superfície celular para o compartimento de sulfatação.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transporte de proteínas e membranas de superfície celular para o Golgi e além é essencial para a homeostase, organela identidade e fisiologia. Para estudar o tráfego de proteína retrógrada, recentemente desenvolvemos um versátil baseado em nanobody toolkit para analisar o transporte de superfície celular para o complexo de Golgi, quer por células fixas e ao vivo de imagens, por microscopia electrónica, ou bioquimicamente. Nós produzimos funcionalizados antiproteína verde fluorescente (GFP) nanobodies — ligantes pequenos, monomérico, alta afinidade da proteína — que pode ser aplicado a linha celular expressam proteínas de membrana de interesse com um moiety extracelular de GFP. Nanobodies pyrazole vinculados para os repórteres de GFP especificamente são internalizados e transportado às costas ao longo das rotas de classificação dos repórteres. Nanobodies foram acrescidas com fluorophores siga transporte retrógrado por microscopia de fluorescência e viver de imagem, com peroxidase de ascorbato 2 (APEX2) para investigar a localização ultra-estrutural do repórter-nanobody complexos por elétrons microscopia e com motivos de tirosina sulfatação (TS) para avaliar a cinética da chegada de rede (TGN) trans-Golgi. Neste artigo metodológico, descrevem o procedimento geral para o modo express e purificar nanobodies funcionalizados. Ilustramos o uso poderoso de nossa ferramenta usando o nanobodies mCherry - e TS-modificado para analisar a captação endocítica e TGN chegada de proteínas de carga.

Para investigar o transporte retrógrado proteína para vários destinos intracelulares, nós temos estabelecido recentemente uma ferramenta baseada em nanobody de anti-GFP para rotular e siga as proteínas recombinantes de fusão entre a superfície celular30. Aqui, demonstramos a produção bacteriana de tais derivatizado nanobodies e demonstrar sua aplicação para estudar endocítica absorção por microscopia de fluorescência e immunoblotting, bem como a sua ...

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Análise de absorção endocítica e transporte retrógrado à rede Trans-Golgi usando funcionalizados Nanobodies em culturas de células

Transporte retrógrado de proteínas de superfície celular para o Golgi é essencial para manter a homeostase de membrana. Aqui, descrevemos um método para analisar bioquimicamente transporte de superfície-para-Golgi celular de proteínas recombinantes usando funcionalizados nanobodies em células HeLa.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Este método permite a produção e a aplicação de nano corpos expressos e funcionalizados bacterianos para analisar o transporte de proteínas retrógradas da superfície celular para compartimentos intercelulares. Em particular a rede Trans-Golgi. A principal vantagem dessa técnica é o uso da sulfação. Uma modificação pós-tradução altamente específica, compartimentalizada e sensível para avaliar a chegada do complexo nano-corpo do repórter no compartimento DTN. Este método em combinação com outros nano-corpos derivados para imagem de células de vida e microscopia eletrônica também pode ser usado para estudar processos endociticos de receptores de superfície celular relacionados à doença. Nosso repertório de nano-corpos funcionalizados foi projetado para estudar o transporte retrógrado em células cultivadas. No entanto, essas ferramentas também podem ser aplicadas em organismos multicelulares. Para iniciar este procedimento, escolha uma colônia bacteriana contendo o vetor de interesse da placa e inocula um frasco contendo 20 mililitros de meio LB complementado com antibióticos. Incubar durante a noite aos 37

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