Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Эта работа была поддержана Грант 31003A-162643, Швейцарский Национальный научный фонд. Мы благодарим, Николь Beuret и Biozentrum Imaging основного фонда (IMCF) для поддержки.

1. бактериальные преобразование с функционализированных Nanobodies
Примечание: Этот протокол был оптимизирован для выражения, очистки и анализа функционализированных анти GFP nanobodies как описано30. Деривации с другими белками постановление могут потребова?...

Nanobodies представляют собой возникающих класса белка связыватель подмости с много преимуществ перед обычными антитела: они небольшие, стабильной, мономерных, может быть выбран для высокое сродство и отсутствие дисульфида облигации33,35, 44...

Ретроградное движение белков и липидов из клеточной поверхности различных внутриклеточных отделений имеет решающее значение для поддержания гомеостаза мембраны в противовес секрецию и перерабатывать компоненты антероградная транспортных механизмов1 , 2. После интернализации через Клатрин зависимые или - независимые эндоцитоза, белков и липидов грузов сначала заполнить рано endosomes от где они дальнейшее перенаправление либо вдоль Эндо лизосомальных системы, переработанных в плазматической мембране, или для транс Гольджи сети (TGN). Рециркуляции из endosomes и/или поверхности клетки к TGN является частью функциональной цикла количество рецепторов антероградная трансмембранного груза, например катион зависимых и катион независимые рецепторы маннозы-6-фосфат (CDMPR и CIMPR) доставки недавно синтезированных лизосомальных гидролаз в конце endosomes и лизосом3,4,5, sortilin и SorLA6,7и Wntless (WLS) транспортировки Wnt лигандов на поверхности клеток от TGN 8 , 9 , 10 , 11. другие белки, полученные обратно к TGN являются TGN46 и ее смежных изоформ12,13,14, сковывания (растворимые N- ethylmaleimide-чувствительных фьюжн фактор вложение рецепторы) 15 , 16 , 17, амилоида прекурсоров протеина (APP)18,19, прогрессивный Анкилоз (АНК) белка20, металла перевозчиков например ATP7A/B или DMT121,22и трансмембранного переработки ферментов, включая Карбоксипептидаза D, Фурин или BACE123,24,25. Помимо этих эндогенных белков завод и бактериальные токсины (например, Сига и холера токсин, рицин и Абрин) угона Ретроградная транспортных механизмов для достижения ER для retrotranslocation в цитозоль26,27, 28,29.
Для того, чтобы непосредственно анализировать ретроградного движения, мы разработали ранее на основе наночастицы Инструментарий ярлык и следовать груз белки от поверхности клетки внутриклеточных отсеков30. Nanobodies представляют собой новое семейство белков вяжущих материалов, полученных от м.в тяжелые цепи только-антител (hcAbs) естественно возникающие в верблюдовых и хрящевых рыб31,32. Они представляют собой переменной домена тяжелых цепей (VHH) hcAbs и имеют много преимуществ перед обычными антител (например, IgGs): они мономерных, малые (~ 15 кДа), высоки soluble, лишенный дисульфидными облигаций, может быть бактериально выражена и для Высокоспецифичные связывающие33,34,35,36. Чтобы сделать наш инструмент наночастицы, универсальным и широко применимые, мы заняты функционализированных анти GFP nanobodies поверхность лейбл и трек белки, отмеченных GFP в их lumenal/внеклеточного домена. Функционализация nanobodies с mCherry, аскорбатпероксидазы 2 (APEX2)37, или сульфатация (TS) последовательности тирозин, ретроградная транспорта bonafide трансмембранного грузов белков может быть проанализирован либо фиксированной и жить клеток изображений, Электронная микроскопия, или биохимически. Поскольку сульфатация тирозина, опосредовано tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 и TPST2) является Посттрансляционная модификация ограничивается транс Гольджи/TGN, мы можем непосредственно изучать транспорта и кинетика протеинов интереса от поверхности клетки к этому внутриклеточных Гольджи отсека38,,3940.
В этой статье методы мы описываем простота производства функционализированных nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry и производные) подходит для ряда приложений для анализа Ретроградная транспорт в mammalian клетках30. Мы главным образом сосредоточиться на использовании TS сайт изменен наночастицы для анализа внутриклеточных трафика от поверхности клетки в отделение сульфатация.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Транспорт белков и мембран от поверхности клетки Golgi и за ее пределами имеет важное значение для гомеостаза, органелл идентичности и физиологии. Для изучения движение ретроградное белка, мы недавно разработали универсальный инструментарий на основе наночастицы для анализа транспорта от поверхности клеток Гольджи комплекс, либо по фиксированной и живой клетки изображений, электронной микроскопии, или биохимически. Мы инженерии функционализированных анти Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) nanobodies — маленький, мономерных, высокоспецифичных белка связующих — которые могут применяться для клеточных линий, выражая мембранных белков интерес с внеклеточного GFP остаток. Дериватные nanobodies привязан к журналистам GFP конкретно учитываются и транспортируется контрейлерных перевозок по маршрутам сортировки журналистов. Nanobodies были функционализированных с флуорофоров следуют микроскопии флуоресцирования Ретроградная транспорта и жить изображений, с аскорбатпероксидазы 2 (APEX2) расследовать ультраструктурных локализации репортер наночастицы комплексов электрона микроскопия и с сульфатация (TS) мотивы тирозин оценить кинетику транс Гольджи сети (TGN) прибытия. В этом методологические статьи мы приводим общие процедуры бактериально Экспресс и очистить функционализированных nanobodies. Мы иллюстрируем мощный использование нашего инструмента, с помощью nanobodies mCherry-TS-изменены и анализировать endocytic поглощения и TGN прибытия грузов белков.

Расследовать Ретроградная белков транспорт в различные пункты назначения внутриклеточные, мы недавно создали анти GFP наночастицы-инструмент для обозначения и следовать рекомбинантных синтез белков из клеток поверхности30. Здесь мы демонстрируем бактер?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Анализ Endocytic поглощения и ретроградным транспорта Trans Гольджи сеть с помощью функционализированных Nanobodies в культивируемых клеток

Ретроградная транспорт белков от поверхности клетки Golgi имеет важное значение для поддержания гомеостаза мембраны. Здесь мы описываем метод биохимически анализа клеток поверхности Гольджи транспорта рекомбинантных белков с помощью функционализированных nanobodies в клетки HeLa.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Этот метод позволяет производство и применение бактериальных выраженных, функционализированных нано-тел для анализа ретроградного транспорта белка от поверхности клетки к межклеточным отсекам. В частности, трансгольгийская сеть. Основным преимуществом этой методики является использование сульфатации. Высокоспецифическая, разобщенные и чувствительные после перевода модификации для оценки репортер нано-тела комплекса прибытия в отсек DTN. Этот метод в сочетании с другими производными нано-телами для визуализации клеток жизни и электронной микроскопии также может быть использован для изучения эндоцитических процессов связанных с болезнью рецепторов поверхности клеток. Наш репертуар функциональных нано-тел был разработан для изучения ретроградного транспорта в культурных клетках. Тем не менее, эти инструменты могут также применяться в многоклеточных организмов. Чтобы начать эту процедуру, выберите бактериальную колонию, содержащую вектор интереса от пластины и привить колбу, содержащую 20 миллилитров LB среды дополняется антибиотиками. Инкубация на ночь в 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Кавитация азота и дифференциального центрифугирования позволяет для контроля за распределением периферийных мембранных белков в культивируемых клеток

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Анализ митохондриальной кальция приток в изолированных митохондриях и культивируемых клеток

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Корректура и ДНК ремонт пробирного анализа единичных нуклеотидных расширение и MALDI-TOF масс-спектрометрии с помощью

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Ультрацентрифугирование градиента плотности для исследования эндоцитарной рециркуляции в клетках млекопитающих

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: оптимизированное приложение для кластеризации коэкспрессии белка и сетевого анализа в протеомике

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Внеклеточное истощение глюкозы как косвенная мера поглощения глюкозы в клетках и тканях Ex Vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...