Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por Grant 31003A-162643 por la Swiss National Science Foundation. Agradecemos a Nicole Beuret y el Biozentrum instalación del núcleo de la proyección de imagen (IMCF) para apoyo.

1. bacteriana transformación con Nanobodies funcionalizados
Nota: Este protocolo ha sido optimizado para la expresión, purificación y análisis de nanobodies funcionalizados anti-GFP como se describió anteriormente30. Derivatización con otras moléculas de proteína puede requerir modificación de este protocolo estándar.
<ol><li>Descongelar las bacterias chemocompetent (~ 100 μL) adecuadas para la expresión de la proteína (p. ej., Escher...

Nanobodies representan una clase emergente de andamios de proteína ligante con muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales: son pequeños, estables, monoméricas, puede seleccionarse para bonos de alta afinidad y falta disulfuro33,35, 44 , 45. se utilizan en un número de aplicaciones, tales como en sistemas de cultivo de células y organismos en el desarrollo de la biología<sup class="x...

Tráfico retrógrado de proteínas y lípidos de la superficie celular en varios compartimientos intracelulares es crucial para el mantenimiento de la homeostasis de la membrana para contrarrestar la secreción y reciclaje de componentes de maquinarias de transporte anterograde1 , 2. después de internalización vía endocytosis clathrin-dependiente - independiente o, carga de proteína y lípidos en primer lugar rellenar temprano endosomas desde donde son más bien a lo largo del sistema endo-lisosomales, reciclado a la membrana plasmática, Redirigido o dirigidas a la red trans-Golgi (TGN). Reciclaje de endosomas y la superficie de la célula al TGN es parte del ciclo funcional de una serie de receptores de transmembrana carga anterógrada, tales como los receptores de manosa-6-fosfato catión-dependiente y la independiente del catión (CDMPR y CIMPR) entrega recién sintetizado lisosomales hidrolasas desde el TGN para fines endosomas y lisosomas3,4,5, sortilina, SorLA6,7y Wntless (WLS) transporte de ligandos Wnt a la superficie de la célula 8 , 9 , 10 , 11. otras proteínas obtenidos al TGN son TGN46 y sus isoformas relacionadas12,13,14, trampas ( N- etilmaleimida sensible fusión factor accesorio receptores solubles) 15 , 16 , precursora del amiloide (APP) de la proteína18,19, anquilosis progresiva (ANK) proteína20, 17, transportadores metálicos como ATP7A/B o DMT121,22y transmembrana procesamiento de las enzimas como la carboxipeptidasa D, furin o BACE123,24,25. Aparte de estas proteínas endógenas, toxinas bacterianas y vegetales (por ejemplo, la toxina Shiga y el cólera, ricina y abrina) secuestran maquinarias transporte retrógrado para llegar a la sala de emergencia para retrotranslocation en el citosol26,27, 28,29.
Para analizar directamente tráfico retrógrado, previamente hemos desarrollado un conjunto de herramientas basadas en nanobody etiqueta y seguir las proteínas de carga de la superficie de la célula a compartimientos intracelulares30. Nanobodies representan una nueva familia de proteínas ligantes derivados homodiméricas pesada cadena-sólo anticuerpos (hcAbs) que ocurren naturalmente en camélidos y peces cartilaginosos31,32. Constituyen el dominio variable de cadena pesada (VHH) de hcAbs y tienen muchas ventajas sobre anticuerpos convencionales (por ejemplo, IgGs): son monoméricas, pequeño (~ 15 kDa), altamente soluble, desprovisto de disulfuro, puede ser bacteriano expresada y seleccionado para alta afinidad de Unión33,34,35,36. Para que nuestra herramienta nanobody versátil y ampliamente aplicables, empleamos funcionalizados anti-GFP nanobodies para etiqueta de superficie y pista proteínas etiquetadas con GFP en su dominio extracelular/lumenal. Funcionalización de nanobodies con mCherry, ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) transporte retrógrado37, o secuencias de sulfatación (TS) de tirosina de las proteínas de transmembrana carga bonafide puede ser analizado ya sea fijo y vive la proyección de imagen de la célula, por microscopia electrónica, o bioquímico. Ya que la sulfatación de la tirosina mediado por Sulfotransferasas tyrosylprotein (TPST1 y TPST2) es una modificación postraduccional restringida para el trans-Golgi/TGN, directamente podemos estudiar transporte y cinética de las proteínas de interés de la superficie celular para esto 38,compartimiento de intracelular Golgi del39,40.
En este artículo de métodos, nos describe la facilidad de producción de nanobodies funcionalizados (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry y derivados) para una serie de aplicaciones para analizar el transporte retrógrado en células de mamíferos30. Nos centramos principalmente en el uso de TS nanobody sitio modificado para el análisis del tráfico intracelular de la superficie celular del compartimiento de sulfatación.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transporte de proteínas y membranas de la superficie celular hasta el Golgi y más allá es esencial para la homeostasis, la identidad de organelas y la fisiología. Para estudiar el tráfico de proteína retrógrada, recientemente hemos desarrollado herramientas basadas en nanobody versátil para analizar el transporte de la superficie celular para el aparato de Golgi, ya sea por proyección de imagen fija y vivo de la célula, por microscopia electrónica o bioquímico. Hemos diseñado nanobodies funcionalizados anti-verde proteína fluorescente (GFP), carpetas pequeñas, monoméricas, de alta afinidad de la proteína, que puede ser aplicado a líneas celulares de expresión de proteínas de membrana de interés con una parte extracelular de la GFP. Derivatizados nanobodies a los reporteros GFP específicamente se internalizan y transportado piggyback a lo largo de vías de clasificación de los reporteros. Nanobodies fueron funcionalizados con fluoróforos transporte retrógrado por microscopía de fluorescencia y proyección de imagen, con ascorbato peroxidasa 2 (APEX2) para investigar la localización ultraestructural del reportero nanobody complejos de electrónica en vivo microscopia y con motivos de tirosina sulfatación (TS) para evaluar la cinética de la llegada de trans-Golgi network (TGN). En este artículo metodológico, describiremos el procedimiento general para expresar y purificar nanobodies funcionalizados para bacteriano. Ilustramos el uso poderoso de nuestra herramienta usando los nanobodies mCherry y TS modificado para analizar endocíticas absorción y llegada del TGN de proteínas de carga.

Para investigar el transporte retrógrado de la proteína a diferentes destinos intracelulares, recientemente hemos establecido una anti-GFP nanobody-herramienta para la etiqueta y siga las proteínas recombinantes de fusión de la superficie de la célula30. Aquí, demostramos la producción bacteriana de tal derivatizada nanobodies y demostrar su aplicación al estudio de absorción endocíticas por microscopía de fluorescencia y immunoblotting, así como su uso...

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Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Análisis de absorción endocíticas y transporte retrógrado a la red Trans-Golgi en células cultivadas de Nanobodies funcionalizados

Transporte retrógrado de proteínas de la superficie de la célula al Golgi es esencial para mantener la homeostasis de la membrana. Aquí, describimos un método para analizar bioquímicamente transporte de superficie de Golgi de la célula de proteínas recombinantes utilizando nanobodies funcionalizados en células HeLa.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Este método permite la producción y aplicación de nanosí cuerpos funcionalizados y expresados bacterianos para analizar el transporte de proteínas retrógradas desde la superficie celular hasta compartimentos intercelulares. En particular, la red Trans-Golgi. La principal ventaja de esta técnica es el uso de la sulfatación. Una modificación altamente específica, compartimentada y sensible después de la traducción para evaluar la llegada del complejo de nano-cuerpo de reportero en el compartimiento DTN. Este método en combinación con otros nano-cuerpos derivados para la exploración celular de la vida y la microscopía electrónica también se puede utilizar para estudiar los procesos endolíticos de los receptores de superficie celular relacionados con la enfermedad. Nuestro repertorio de nano-cuerpos funcionalizados ha sido diseñado para estudiar el transporte retrógrado en células cultivadas. Sin embargo, estas herramientas también se pueden aplicar en organismos multicelulares. Para comenzar este procedimiento, escoja una colonia bacteriana que contenga el vector de interés de la placa e inocular un matraz que contenga 20 mililitros de medio LB complementado con antibióticos. Incubar durante la noche a los 37 años

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