Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Detta arbete stöds av Grant 31003A-162643 av den schweiziska National Science Foundation. Vi tackar Nicole Beuret och Basels Imaging Core Facility (IMCF) för support.

1. bakteriell omvandling med Functionalized Nanobodies
Obs: Detta protokoll har optimerats för uttryck, rening och analys av functionalized anti-GFP nanobodies som tidigare beskrivits30. Derivatisering med andra protein beståndsdelarna kan kräva en ändring av denna standard protokoll.
<ol><li>Tina chemocompetent bakterier (~ 100 µL) lämpad för proteinuttryck (t.ex. Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) celler) genom att placera dem på i...

Nanobodies representerar en framväxande klass av proteinet binder ställningar med många fördelar jämfört med konventionella antikroppar: de är små, stabil, monomer, kan väljas för hög affinitet och brist disulfide obligationer33,35, 44 , 45. de används i ett antal applikationer, såsom i cellsystem kultur och organismer i utvecklingsbiologi46,<sup ...

Retrograd trafik av proteiner och lipider från cellytan till olika intracellulära fack är avgörande för underhåll av membran homeostas motvikt sekretion och att återvinna komponenter anterograd transport maskinerier1 , 2. efter internalisering via clathrin-beroende eller -oberoende endocytos, protein och lipid last först fylla tidigt endosomes från där de är ytterligare Omdirigerad antingen längs endo-lysosomala systemet, återvinns till plasmamembranet, eller riktade till nätverkets trans-Golgi (TGN). Återvinning från endosomes eller cellytan till TGN är en del av funktionell cykel av ett antal anterograd transmembrana last receptorer som katjon-beroende och katjon-oberoende mannos-6-fosfat receptorerna (CDMPR och CIMPR) att leverera Nyligen syntetiseras lysosomala hydrolaser från TGN till sena endosomes och lysosomer3,4,5, sortilin och SorLA6,7, och Wntless (WLS) transportera Wnt ligander till cellytan 8 , 9 , 10 , 11. andra proteiner som Hämtad tillbaka till TGN är TGN46 och dess relaterade isoformer12,13,14, snaror (lösliga N- ethylmaleimide-känslig fusion faktor fastsättning receptorer) 15 , 16 , 17, amyloid prekursor protein (APP)18,19, progressiv fixation (ANK) protein20, metall transportörer såsom ATP7A/B eller DMT121,22, och transmembrana bearbetning enzymer inklusive karboxypeptidas D, furin eller BACE123,24,25. Förutom dessa kroppsegna proteiner kapa bakteriell och växt toxiner (t.ex. Shiga och kolera toxin, ricin och abrin) retrograd transport maskinerier för att nå ER för retrotranslocation in i det cytosol26,27, 28,29.
För att direkt analysera retrograd trafik, har vi tidigare utvecklat en nanobody-baserad verktygslåda för att märka och följ last proteiner från cellytan till intracellulär fack30. Nanobodies representerar en ny familj av protein bindemedel härrör från homodimeric heavy-kedja-bara antikroppar (hcAbs) som förekommer naturligt i kameldjur och broskfiskar31,32. De utgör variabeln heavy-kedjan domän (VHH) hcAbs och har många fördelar jämfört med konventionella antikroppar (t ex IgG): de är monomer, små (~ 15 kDa), lättlösligt, saknar disulfide obligationer, kan bacterially uttryckt och valts för hög affinitet bindande33,34,35,36. För att göra vår nanobody verktyg mångsidigt och brett tillämpliga, anställt vi functionalized anti-GFP nanobodies till ytan-etikett och spår proteiner taggade med GFP på sin extracellulära/lumenal domän. Av funktionalisering av nanobodies med mCherry, askorbat peroxidas 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfatering (TS) sekvenser, retrograd transport av bonafide transmembrana last proteiner kan analyseras genom att antingen fast och leva cell imaging, genom elektronmikroskopi, eller biokemiskt. Eftersom tyrosin sulfatering medieras av tyrosylprotein sulfotransferaser (TPST1 och TPST2) är en posttranslationell modifiering är begränsad till de trans-Golgi/TGN, kan vi direkt studera transport och kinetik av proteiner av intresse från cellytan till detta intracellulära Golgi fack38,39,40.
I den här metoder artikeln beskriver vi lättheten av produktion av functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry och derivat) lämpad för ett antal applikationer att analysera retrograd transport i däggdjursceller30. Vi fokuserar huvudsakligen på användningen av TS webbplats-modifierat nanobody för analys av intracellulära trafik från cellytan till utrymmet av sulfatering.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Transport av proteiner och membran från cellytan till Golgi och därefter är viktigt för homeostas, organell identitet och fysiologi. För att studera retrograd protein trafik, har vi nyligen utvecklat en mångsidig nanobody-baserade verktyg för att analysera transport från cellytan till Golgi komplexet, antingen genom fasta och levande cell imaging, genom elektronmikroskopi eller biokemiskt. Vi konstruerade functionalized anti grönt fluorescerande protein (GFP) nanobodies – små, monomer, hög affinitet protein bindemedel — som kan tillämpas på cellinjer som uttrycker membranproteiner intresse med en extracellulär GFP biexponentiellt. Derivatized nanobodies bunden till GFP reportrar är specifikt internaliserats och transporteras piggyback längs de reportrarna sortering rutter. Nanobodies var functionalized med fluorophores att följa retrograd transport genom fluorescensmikroskopi och leva imaging, med askorbat peroxidas 2 (APEX2) att undersöka ultrastrukturella lokaliseringen av reporter-nanobody komplex av elektron Mikroskopi, och med tyrosin sulfatering (TS) motiv att bedöma kinetik av trans-Golgi nätverk (TGN) ankomst. I denna metodologiska artikel beskriva vi det allmänna förfarandet för att bacterially express och rena functionalized nanobodies. Vi illustrerar den kraftfulla användningen av vårt verktyg använder de mCherry - och TS-modifierat nanobodies att analysera endocytic upptag och TGN ankomsten av last proteiner.

För att undersöka retrograd proteintransport till olika intracellulära destinationer, har vi nyligen etablerat ett anti-GFP nanobody-baserat verktyg för att märka och följ rekombinant fusionsproteinerna från cell surface30. Här visar vi bakteriell produktion av sådan derivatized nanobodies och demonstrera sin ansökan att studera endocytic upptag av fluorescensmikroskopi immunoblotting, samt deras användning att undersöka TGN ankomst genom sulfatering an...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Analys av Endocytic upptag och retrograd Transport till Trans-Golgi nätverket med Functionalized Nanobodies i odlade celler

Retrograd transporten av proteiner från cellytan till Golgi är viktigt att upprätthålla membran homeostas. Här, beskriver vi en metod för att analysera biokemiskt cell surface-till-Golgi transport av rekombinanta proteiner med functionalized nanobodies i HeLa cells.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Denna metod möjliggör produktion och tillämpning av bakteriell uttryckta, funktionaliserade nano-kroppar för att analysera retrograd proteintransport från cellytan till intercellulära fack. I synnerhet Trans-Golgi-nätet. Den största fördelen med denna teknik är användningen av sulfation. En mycket specifik, uppdelad och känslig efter översättning modifiering för att bedöma reporter nano-body komplex ankomst i DTN facket. Denna metod i kombination med andra derivatiserade nano-kroppar för avbildning av livcells- och elektronmikroskopi kan också användas för att studera endocitiska processer av sjukdomsrelaterade cellytreceptorer. Vår repertoar av funktionaliserade nano-kroppar har konstruerats för att studera bakåtsträvande transporter i odlade celler. Dessa verktyg kan dock även tillämpas i flercelliga organismer. För att påbörja detta förfarande, plocka en bakteriekoloni som innehåller vektorn av intresse från plattan och inokulera en kolv som innehåller 20 milliliter LB medium kompletterat med antibiotika. Inkubera över natten vid 37

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Kväve kavitation och differentiell centrifugering tillåter övervakning fördelningen av perifera membranproteiner på odlade celler

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Korrekturläsning och DNA reparation Assay använder Single Nucleotide förlängning och MALDI-TOF-masspektrometri.

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Densitet gradient ultracentrifugation för att undersöka endocytisk återvinning i däggdjursceller

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: En strömlinjeformad applikation för protein-samuttryckskluster och nätverksanalys inom proteomik

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Rutinmässig insamling av högupplösta kryo-EM-dataset med 200 KV transmissionselektronmikroskop

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellulär glukosutarmning som ett indirekt mått på glukosupptag i celler och vävnader ex vivo

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...