Name: analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Bu eser Grant 31003A-162643 tarafından İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. Nicole Beuret ve Biozentrum Imaging Core tesisi (IMCF) destek için teşekkür ederiz.

1. Functionalized Nanobodies ile bakteriyel dönüştürme
Not: Bu iletişim kuralı yukarıda açıklanan30ifade, arıtma ve functionalized anti-GFP nanobodies analizi için optimize edilmiştir. Derivatization diğer protein moieties ile bu standart protokol değişikliği gerektirebilir.
<ol><li>Chemocompetent bakteri (~ 100 µL) protein ifade için uygun çözülme (örneğin, Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3) hücreleri) buz yerleştir...

Nanobodies protein bağlayıcı iskele geleneksel antikorlar üzerinden pek çok avantajları ile ortaya çıkan bir sınıfı temsil: Bunlar küçük, istikrarlı, monomeric,33,35, yüksek benzeşme ve eksikliği disülfür bağları için seçilen 44 , 45. hücre kültür sistemleri ve gelişim biyolojisi46,47,organizmalard...

Proteinler ve çeşitli hücre içi bölmeleri için hücre yüzeyinden lipidler retrograd Rating membran homeostazı salgı dengelemek için ve bileşenleri anterograd taşıma makineleri1 geri dönüşüm için bakımı için önemlidir , 2. clathrin bağlı veya - bağımsız endositoz ile içselleştirilmesi, protein ve lipit kargo ilk doldurmak erken endosomes daha fazla nerede üzerinden ya plazma zarı için geri dönüşümlü endo lizozomal sistemi boyunca yönlendirildi veya hedeflenen trans-Golgi ağa (TGN). Endosomes ve/veya hücre yüzeyine gelen TGN için geri dönüşüm anterograd transmembran kargo reseptörleri ba * bağlı ve katyon bağımsız mannoz-6-fosfat reseptörleri (CDMPR ve CIMPR) gibi bir dizi fonksiyonel döngüsünün bir parçası olduğunu teslim etmek Yeni sentezlenen lizozomal TGN geç endosomes ve organellerin3,4,5, sortilin ve SorLA6,7ve Wntless (WLS) Wnt ligandlar hücre yüzeyine taşınması için hidrolazlar 8 , 9 , 10 , 11. TGN46 ve onun ilgili izoformlarının12,13,14, tuzaklarına (çözünür N- ethylmaleimide-duyarlı füzyon faktör eki reseptörleri) geri TGN için alındı diğer proteinler vardır 15 , 16 , 17, amiloid precursor protein (APP)18,19, ilerleyici eklem (ANK) protein20, ATP7A/B veya DMT121,22gibi ve transmembran metal taşıyıcı enzimler Karboksipeptidaz D, furin veya BACE123,24,25gibi işleniyor. Endojen bu proteinler dışında bakteriyel ve bitki toksinler (örneğin, Shiga ve kolera toksini, risin ve abrin) retrotranslocation için ER sitozol26,27ulaşmak için retrograd taşıma makineleri kaçırmak, 28,29.
Doğrudan retrograd trafiğini analiz için biz daha önce etiket ve kargo proteinler hücre yüzeyinden hücre içi bölmeleri30' a takip nanobody tabanlı bir araç geliştirdik. Nanobodies protein bağlayıcı Devegiller ve kıkırdaklı balıklar31,32içinde doğal olarak oluşan homodimeric ağır zinciri yalnızca antikorlar (hcAbs) türetilen yeni bir aile temsil eder. HcAbs değişken ağır zincir etki alanını (VHH) teşkil ve geleneksel antikorlar (örneğin, IgGs) üzerinde pek çok avantajı var: onlar monomeric, küçük (~ 15 kDa), yüksek oranda çözünür, disülfür bağları, yoksun bacterially ifade ve seçilmiş yüksek-benzeşme bağlama33,34,35,36. Bizim nanobody araç çok yönlü ve geniş uygun yapmak için functionalized anti-GFP nanobodies tagged GFP onların hücre dışı/lumenal etki ile yüzey-etiket ve parça proteinlere çalıştırmaya başladık. Nanobodies (APEX2) mCherry, askorbat peroksidaz 2 ile functionalization tarafından37veya tirozin sulfation (TS) dizileri, retrograd taşıma bonafide transmembran kargo proteinlerin sabit ya da-ebilmek var olmak çözümlemek ve hücre görüntüleme, yaşamak elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak. Tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 ve TPST2) aracılı tirozin sulfation ardından bir değişiklik için trans-Golgi sınırlı olduğundan/TGN, biz doğrudan çalışma taşıma ve Kinetik bu hücre yüzeyinden ilgi proteinlerin Hücre içi Golgi yuvası38,39,40.
Bu yöntemleri makalede, biz functionalized nanobodies (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry ve türevleri) memeli hücreleri30retrograd Ulaştırma analiz etmek için uygulamalar için uygun üretim kolaylığı tanımlamak. Biz esas olarak TS siteyi değiştiren nanobody kullanım için sulfation yuvası hücre yüzeyinden hücre içi trafik analiz odaklanın.

<table >
	
		
		
		
		
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Anti-GFP antibody</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >118144600001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-His6 antibody</td>
			<td >Bethyl Laboratories</td>
			<td >A190-114A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Anti-actin antibody</td>
			<td >EMD Millipore</td>
			<td >MAB1501</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-rabbit HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0545</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Goat anti-mouse HRP</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A-0168</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D9542</td>
			<td >dissolved in 1 x PBS/1%BSA</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3672</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >D-biotin</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B4501</td>
			<td >dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A3785</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DNase I</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3778</td>
			<td >dissolved in sterile water</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Lysozyme</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >18037059001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Brefeldin A (BFA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B5936</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Puromycin</td>
			<td >Invivogen</td>
			<td >ant-pr-1</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Penicillin/Streptomycin</td>
			<td >Bioconcept</td>
			<td >4-01F00-H</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >L-glutamine</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3704</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D5796</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal calf serum (FCS)</td>
			<td >Biowest</td>
			<td >S181B-500</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sulfur-35 as sodium sulfate</td>
			<td >Hartmann Analytics</td>
			<td >ARS0105</td>
			<td >Product contains 5 mCi</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Earle&#39;s balanced salts</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >E6267</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM amino acids (50 x) solution</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M5550</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MEM vitamin solution (100 x)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >M6895</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >11836153001</td>
			<td >Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1008</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Carbenicillin disodium salt</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1491</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Kanamycin sulfate</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1493</td>
			<td >dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Coomassie-R (Brilliant Blue)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >B-0149</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A3813</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >A2153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fluoromount-G</td>
			<td >Southern Biotech</td>
			<td >0100-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ni Sepharose High Performance</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >17-5268-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His GraviTrap columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0033-99</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >His buffer kit</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE11-0034-00</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Disposable PD10 desalting columns</td>
			<td >GE Healthcare</td>
			<td >GE17-0851-01</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well</td>
			<td >Bio-Rad</td>
			<td >456-1096</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >D8537</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >35-mm dishes</td>
			<td >Falcon</td>
			<td >353001</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates</td>
			<td >TPP</td>
			<td >92406</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass coverslips (No. 1.5H)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >631-0153</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A0999.0025</td>
			<td >dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Tryptone</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1553</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Yeast extract</td>
			<td >Applichem</td>
			<td >A1552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >105833</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Calcium chloride dihydrate</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >102382</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 1 M</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sodium chloride</td>
			<td >Merck Millipore</td>
			<td >106404</td>
			<td>dissolved in sterile water, stock is 5 M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of endocytic uptake and retrograde transport to the trans-golgi network using functionalized nanobodies in cultured cells

Proteinler ve membran hücre yüzeyinden Golgi ve ötesine taşıma Homeostazı, organel kimlik ve Fizyoloji için esastır. Retrograd protein Rating çalışmaya, biz son zamanlarda hücre yüzeyinden ışınlamaya Golgi kompleksi, ya sabit ve canlı hücre Imaging, elektron mikroskobu, ya da biyokimyasal olarak analiz etmek için çok yönlü bir nanobody tabanlı araç geliştirdik. Functionalized Anti-yeşil flüoresan protein (GFP) nanobodies mühendislik — küçük, monomeric, yüksek-benzeşme protein bağlayıcı — membran proteinlerinin bir hücre dışı GFP yan ile ilgi ifade hücre hatları için uygulanabilir. Derivatized nanobodies GFP gazetecilere bağlı özellikle içselleştirilmiş ve gazetecilere sıralama güzergah boyunca sırtlama nakletti. Nanobodies retrograd taşıma Floresans mikroskobu tarafından takip etmek ve askorbat peroksidaz 2 elektron tarafından muhabir-nanobody kompleksleri ultrastructural lokalizasyonu araştırmak için (APEX2) ile görüntülemede canlı fluorophores ile functionalized mikroskobu ve Kinetik trans-Golgi ağ (TGN) varış değerlendirmek için tirozin sulfation (TS) motiflerle. Bu yöntembilimsel makalede, biz bacterially hızlı ve functionalized nanobodies arındırmak için genel yordamı anahat. Biz bizim aracı endositik alımı ve kargo proteinler varış TGN analiz etmek için mCherry ve TS modifiye nanobodies kullanarak güçlü kullanımını göstermektedir.

Retrograd protein taşıma çeşitli hücre içi hedeflere araştırmak için biz son zamanlarda etiket ve rekombinant füzyon proteinler hücre yüzey30takip nanobody tabanlı bir anti-GFP aracı kurduk. Burada, biz böyle bakteri üretimi nanobodies derivatized ve endositik alımını Floresans mikroskobu ve immunoblotting yanı sıra TGN varış göre sulfation analizi araştırmak için bunların kullanımı eğitim için kendi uygulama göstermek göstermek. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells at JoVE.com

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Endositik alımını ve kültürlü hücrelerde Functionalized Nanobodies kullanarak Trans-Golgi ağına retrograd taşıma analizi

Golgi için hücre yüzeyinden proteinlerin retrograd taşıma membran homeostazı korumak için önemlidir. Burada, biyokimyasal olarak hücre yüzey Golgi taşıma rekombinant proteinlerin functionalized nanobodies HeLa hücreleri kullanarak analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Bu yöntem, hücre yüzeyinden hücre içi bölmelere retrograd protein taşımaanaliz etmek için bakteriyel ifade, işlevsel nano-cisimlerin üretimi ve uygulanmasını sağlar. Özellikle Trans-Golgi ağı. Bu tekniğin en büyük avantajı sülfasyon kullanımıdır. DTN bölmesine muhabir nano-vücut kompleksi gelişini değerlendirmek için son derece spesifik, bölümlere ayrılmış ve hassas çeviri sonrası modifikasyon. Yaşam hücresi görüntüleme ve elektron mikroskobu için diğer türev nano-cisimler ile birlikte bu yöntem de hastalık ile ilgili hücre yüzey reseptörlerinin endokrinsüreçlerini incelemek için kullanılabilir. İşlevselleştirilmiş nano-cisimlerin repertoiremiz, kültürlü hücrelerde retrograd taşımayı incelemek üzere tasarlandı. Ancak, bu araçlar çok hücreli organizmalarda da uygulanabilir. Bu prosedüre başlamak için, plaka ilgi vektöriçeren bir bakteri kolonisi seçin ve antibiyotikler ile desteklenen LB orta 20 mililitre içeren bir şişe aşılamak. 37 gecede kuluçka

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Membrane Traffic

SCIENTISTS IN ACTION

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

Azot kavitasyon ve diferansiyel Santrifüjü sağlar periferik membran proteinlerinin kültürlü hücrelerdeki dağılımını izlemek için

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Mitokondrial kalsiyum akını izole mitokondri ve kültürlü hücreleri analizleri

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Proofreading and DNA Repair Assay Using Single Nucleotide Extension and MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis

Proofreading ve DNA onarım tahlil tek nükleotid uzama ve MALDI-TOF Kütle spektrometresi analizi ile

The maintenance of the genome and its faithful replication is paramount for conserving genetic information. To assess high fidelity replication, we have ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Density Gradient Ultracentrifugation for Investigating Endocytic Recycling in Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinde Endosit Geri Dönüşümü Araştırmak için Yoğunluk Gradyan Ultracentrifugation

Endosomal trafficking is an essential cellular process that regulates a broad range of biological events. Proteins are internalized from the plasma ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

JUMPn: Proteomikte Protein Ko-İfade Kümelemesi ve Ağ Analizi için Kolaylaştırılmış Bir Uygulama

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 KV İletim Elektron Mikroskobu Kullanarak Yüksek Çözünürlüklü Kriyo-EM Veri Kümelerinin Rutin Toplanması

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Extracellular Glucose Depletion as an Indirect Measure of Glucose Uptake in Cells and Tissues Ex Vivo

Ex Vivo'da Hücrelerde ve Dokularda Glikoz Alımının Dolaylı Bir Ölçüsü Olarak Hücre Dışı Glikoz Tükenmesi

The ongoing worldwide epidemic of diabetes increases the demand for the identification of environmental, nutritional, endocrine, genetic, and epigenetic ...