Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

ويشكر المؤلفان رازفان كوجوكارو وأمير عبد الله زاده على مساعدتهما التقنية، ولينا دولغوشينا على تصحيح المخطوطة. وتم تمويل هذا المشروع من منحة تشغيلية قدمها المجلس الكندي للبحوث الطبيعية والبحوث الهندسية إلى منظمة بي جي يو.

1. إعداد الكواشف
<ol><li>
TO1-البيوتين بعد البقع الحل (هلام تلطيخ الحل)
	<ol>
<li>جعل 1 L من 1 M الفوسفات العازلة في درجة الحموضة 7.2 عند 25 درجة مئوية عن طريق إضافة 342 مل من 1 M من Na2HPO4 و 158 مل من 1 م NaH2PO4. ضبط رقم الألف إلى 7.2 في 50 mM عن طريق إضافة حل الفوسفات المناسب. معقمة تصفية ب...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

ميزة كبيرة من علامة المانجو الفلورسنت هو أنه يمكن استخدام علامة واحدة بطرق متعددة. سطوع عالية والتقارب من هذه aptamers جعلها مفيدة ليس فقط لفي تصور الخلية2 ولكن أيضا لRNA في المختبر أو تنقية RNP4. ولذلك، هلام التصوير يمتد براعة العلامة المانجو بطريقة مباشرة. حساسية التصو...

المانجو هو نظام وسم الجيش الملكي النيبالي يتكون من مجموعة من أربعة aptamers RNA الفلورسنت الصغيرة التي تربط بإحكام (nanomolar ملزمة) إلى مشتقات بسيطة من الثيازول البرتقالي (TO1-البيوتين، الشكل 1A)1،2،3 . عند الربط، يتم زيادة الفلورسنت من هذا ليجاند 1000- إلى 4،000 أضعاف اعتمادا على aptamer محددة. السطوع عال من المانجو نظامة, أيّ ل مانجو [إييي] يتجاوز أنّ من يعزّز بروتين خضراء [فلورسنت] ([إجفب]), يضمّ مع ال [ننوملور] التصاق تقارب من ال [رنا] مانجو [أبتمرس], يسمح هو أن يكون استعملت على حدّ سواء في التصوير والتطهير من [رنا] مجمعات2,4.
وقد تم تحديد هياكلالأشعة السينية من المانجو الأول 5، II6،وIII7 إلى دقة عالية، وجميع aptamers الثلاثة تستخدم رباعية RNA لربط TO1-البيوتين (الشكل1B-D). يتم عزل النوى المدمجة من جميع aptamers الثلاثة من تسلسل الجيش الملكي النيبالي الخارجي عن طريق زخارف محول المدمجة. المانجو الأول والثاني على حد سواء الاستفادة من مرنة GNRA مثل حلقة محول لربط النوى المانجو إلى ثنائي الحمض النووي الريبي التعسفي (الشكل1B،C). وعلى النقيض من ذلك، يستخدم مانجو الثالث عزر ثلاثي جامد لربط جوهره بحلزونية RNA اعتباطية (الشكل1D، بقايا الأرجواني)، في حين أن بنية مانجو الرابع غير معروف حاليا. بما أنّ ال [ليغّد-لّس] لب من كلّ من هذا [أبتمرس] يكون فصلت من ال [رنا] خارجيّة تسلسل ب هذا محولات حلزونيّة, يبدو هو على الأرجح أنّ هم يستطيع كلّ كنت ببساطة أدمجت داخل تشكيل ال [رنا]. وقد تم وضع علامة على 6S البكتيرية التنظيمية RNA (مانجو الأول)، مكونات من spliceosome الخميرة (مانجو الأول)، و5S الإنسان الجيش الملكي النيبالي، U6 الجيش الملكي النيبالي، وscaRNA C / D (مانجو الثاني والرابع) كل بنجاح الموسومة في هذا الأزياء2،8، مما يشير إلى أن العديد من يمكن وضع علامات RNAs البيولوجية باستخدام نظام APTAMER المانجو RNA.
تستخدم عادة ً المواد الهلامية والطبيعية لدراسة RNAs. وغالبا ما تستخدم المواد الهلامية التحلل للحكم على حجم RNA أو معالجة الحمض النووي الريبي، ولكن عادة، في حالة وصمة عار الشمالية، على سبيل المثال، تتطلب عدة خطوات بطيئة ومتتابعة من أجل توليد صورة. في حين تم استخدام APTAMERs النابية الفلورية الأخرى، مثل السبانخ والقرنبيط RNA، بنجاح للهلام التصوير9، لا يوجد نظام aptamer الفلورية حتى الآن تمتلك سطوع عالية والتقارب من نظام المانجو، مما يجعلها ذات أهمية كبيرة للتحقيق في قدرات مانجو في التصوير بهلام. في هذه الدراسة، تساءلنا عما إذا كان نظام المانجو RNA يمكن أن تمتد ببساطة إلى التصوير هلام، كما الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات من TO1-البيوتين (510 نانومتر و 535 نانومتر، على التوالي) هي مناسبة للتصوير في قناة eGFP المشتركة لمعظم الفلورسنت هلام المسح الآلات.
يوفر بروتوكول تلطيخ ما بعد الجل المعروض هنا طريقة سريعة للكشف على وجه التحديد عن جزيئات الحمض النووي الريبي التي تحمل علامات المانجو في المواد الهلامية البولي أكريلاميد هلام البولي أكريلاميد الأصلي والتشويه (PAGE). هذه الطريقة تلطيخ ينطوي على نقع المواد الهلامية في العازلة التي تحتوي على البوتاسيوم وTO1-البيوتين. الحمض النووي الريبي المانجو aptamers هي G-رباعية أساس والبوتاسيوم مطلوب لتحقيق الاستقرار في هذه الهياكل. باستخدام RNA نسخت من الحد الأدنى من قوالب الحمض النووي ترميز المانجو (انظر قسم البروتوكول)، يمكننا ببساطة الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة، وذلك باستخدام بروتوكول تلطيخ مباشرة. على النقيض من البقع الحمضية النووية غير محددة المشتركة (انظر جدول المواد، المشار إليها SG من هنا)، يمكننا تحديد بوضوح MANGO-الموسومة الجيش الملكي النيبالي حتى عندما تركيزات عالية من مجموع RNA غير الموسومة موجودة في العينة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

وتستخدم المواد الهلامية البولي أكريلاميد الأصلية والتشويهية بشكل روتيني لوصف حركية الريبونوكليوبروتين (RNP) المعقدة وقياس حجم الحمض النووي الريبي، على التوالي. كما العديد من تقنيات التصوير هلام استخدام البقع غير محددة أو تحقيقات الفلوروفور مكلفة، حساسة، والتمييز، ومنهجيات التصوير الهلام يُستحسن للغاية. إن تسلسلات الرنا مانجو الأساسية هي زخارف تسلسلية صغيرة (19-22 ن) يمكن أن تكون ببساطة وبتكلفة زهيدة ملحقة بالحمض النووي الريبي ذي الأهمية، عندما تكون مغلقة بواسطة جذع RNA تعسفي. هذه العلامات المانجو ربط مع تقارب عالية وخصوصية لالثيازول البرتقالي الفلورية صلة تسمى TO1-البيوتين، الذي يصبح آلاف المرات أكثر الفلورسنت على الربط. هنا نظهر أن المانجو الأول، الثاني والثالث، والرابع يمكن استخدامها لتصوير الحمض النووي الريبي على وجه التحديد في المواد الهلامية مع حساسية عالية. يمكن الكشف عن أقل من 62.5 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية الأصلية و 125 fmol من الحمض النووي الريبي في المواد الهلامية المزيلة عن طريق نقع المواد الهلامية في مخزن التصوير الذي يحتوي على البوتاسيوم و 20 نانوم TO1-البيوتين لمدة 30 دقيقة. نحن نبرهن على خصوصية نظام المانجو الموسومة من خلال تصوير RNA البكتيرية 6S المانجو الموسومة في سياق خليط معقد من مجموع الحمض النووي الريبي البكتيرية.

وأعدت الرناقصيرة التي تحمل علامات المانجو على النحو المبين في قسم البروتوكول. على افتراض أن الفلورسنت في ظروف التشويه سيكون من الصعب مراقبة بسبب وجود اليوريا في المواد الهلامية، درسنا لأول مرة مقاومة aptamers المانجو إلى اليوريا، والتي تعمل كمطهر حمض نووي. وجدنا أن aptamers الم...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

هنا نقدم طريقة حساسة وسريعة، والتمييز بعد جل تلطيخ لصورة RNAs الموسومة مع الجيش الملكي النيبالي المانجو aptamers الأول، الثاني، الثالث، أو الرابع، وذلك باستخدام إما الأصلي أو التشويه البولي أكريلاميد هلام الكهربائي (صفحة) المواد الهلامية. بعد تشغيل المواد الهلامية القياسية الصفحة، يمكن أن تكون ملطخة بسهولة RNA المانجو مع TO1-البيوتين ومن ثم تحليلها باستخدام القراء الفلورسنت المتاحة عادة.

التصور الفلورسنت من الحمض النووي الريبي المانجو الموسومة في المواد الهلامية البولي أكريلاميد عن طريق طريقة بوستينينغ

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

منهجية التصوير هلام الموسومة المانجو أظهرت هنا قوية ومن المتوقع أن تكون قادرة على أن تكون مجرد توسيع من حيث الحساسية وخصوصية. وهذا من شأنه أن يزيد من تبسيط تنقية روتينية من RNAAs الهامة بيولوجيا ومجمعات الحمض النووي الريبي من قبل وسيلة بسيطة لإضافة المانجو العلامة إلى الجيش الملكي النيبالي من الفائدة. ويجري تورط RNAs في المزيد والمزيد من الأمراض لذلك لهذا الأسلوب آخر يرجع تاريخها هو وسيلة سهلة وسريعة لتكون قادرة على تتبع وتصور الجيش الملكي النيبالي.وسوف تكون هناك حاجة إلى مزيد من الرعاية في نقل الجل من مكان إلى آخر كما المواد الهلامية هشة وعرضة للكسر. لإعداد هلام denaturing 30 ملليلتر، حدد أولا النسبة المئوية polyacrylamide مع الأزرق بروموفينول المناسبة، وصبغات السيانول الزيلين مقارنة مع الجيش الملكي النيبالي من الفائدة لضمان فصل الفرقة عالية. ثم، مزيج الحلول A، B، وجيم وفقا للجدول واحد وإضافة وكالة الأنباء الجزائرية و تيمود.صب على الفور حل هلام في جهاز الصب هلام المناسبة. إدراج المخروط المطلوب وترك هلام للبوليمرة لمدة 30 دقيقة تقريبا. تشكل خزان هلام باستخدام 1 XTBE حل وإزالة بعناية المخروط.رفع بعناية حتى هلام وجبل على الجهاز هلام وآمنة باستخدام مقاطع الموثق. باستخدام حقنة، يتبخر من الآبار مباشرة قبل تحميل العينة. إعداد عينات 1X RNA عن طريق إضافة 2X denaturing هلام الحل لتحميل عينات الحمض النووي الريبي من الفائدة.استخدم دراجة حرارة لتسخين العينات عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم، تحميل عينات تبريد إلى الجزء السفلي من كل بئر باستخدام نصائح هلام التحميل. وأيضا هلام في درجة حرارة الغرفة ضمان السلطة منخفضة بشكل فعال لعدم كسر لوحة زجاجية من الجهاز هلام.إعداد 1X هلام تلطيخ حل وفقا للمخطوطة في وعاء زجاجي نظيف واسع بما يكفي لتناسب بشكل مريح هلام. إضافة ما يكفي من 1X هلام تلطيخ حل للحاوية بحيث يتم تغطية هلام تماما مع الحل عندما يتم وضعه على دوار المداري. بمجرد انتهاء الجل من التشغيل ، قم بإزالة الجل من الجهاز ، وقطع آباره ، وركن من الجل من أجل المساعدة في تحديد الاتجاه.ثم، نقل بعناية هلام في حل تلطيخ هلام 1X. لأداء التصوير، قم بفك محلول التلطخ بعناية وشطف الجل بسرعة بالماء. وأخيراً، قم بنقل الجل بعناية إلى الدرج ليتم وضعه في جهاز التصوير.لفة ماصة زجاجية على هلام لإزالة فقاعات المحاصرين والسائل الزائد. والمضي قدما في اتخاذ صورة هلام. المانجو aptamers واحد، اثنين، ثلاثة، أربعة كانت مقاومة كبيرة لdenaturation تصل إلى ما يقرب من تركيز اليوريا الضرس واحد.20 إلى 40 دقيقة تلطيخ الوقت كان كافيا لفلوريس هلام الحد الأقصى. لم يكن الوقت الأطول مناسبًا للرنا الرنا الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة حيث بدأوا في الانتشار من الجل. أظهر تحليل قياس الفلور أن المانجو aptamers واحد واثنين وثلاثة في وجود اليوريا يمكن أن أضعاف بسرعة أكبر من aptamer أربعة.في غياب اليوريا، كان الطي أسرع بكثير كما كان متوقعا. وقد أظهرت حساسية طريقة آخر تلطيخ من قبل عصابات واحدة المقابلة لRNAs مطوية جيدا لكل من المتغيرات المانجو في المواد الهلامية الأصلية و denaturing مع حساسية أقل قليلا عن واحد في وقت لاحق. وكان القياس الكمي للجل الأصلي سجل خطي على مدى أمر واحد من حجم مع المانجو واحد، واثنين، وأربعة يتصرفون بطريقة أكثر خطية من المانجو ثلاثة.وكان القياس الكمي للجل دسينات أكثر خطية مما يشير إلى أن وجود اليوريا في هلام denaturing قد توفر طريقة أكثر تجانسا لطي aptamers بمجرد وضعها في حل تلطيخ البيوتين TO1. يمكن الكشف عن المانجو الموسومة RNAs في وجود الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام تو1 البيوتين تلطيخ مقارنة مع تلطيخ SG. تذكر للتأكد من أن الهلام تلطيخ حاوية كبيرة بما يكفي لتناسب هلام وإلا قد هلام أضعاف على نفسها.عينات الحمض النووي الريبي ستنقل من مكان إلى آخر. على غرار المواد الهلامية denaturing، يمكن تنفيذ هذه الطريقة لجل الأصلي. تشغيل الجل في غرفة باردة في قوة واط أقل للحفاظ على الظروف الأصلية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

طريقة لقياس الحمض النووي الريبي<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine تعديلات في الخلايا والأنسجة

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

وسيلة فعالة لعزل الحمض النووي الريبي العالية النقاء من بذور للاستخدام في التحليل الكمي Transcriptome على

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

تحليل توبرينتينج "الترجمة بدء تشكيل معقدة" في مرناس الثدييات

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

استخراج RNA سريع وفعال من حيث التكلفة من أنسجة البنكرياس الجرذ

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...