Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Forfatterne takker Razvan Cojocaru og Amir Abdolahzadeh for deres tekniske assistance og Lena Dolgosheina for korrekturlæsning af manuskriptet. Der blev ydet støtte til dette projekt af et canadisk naturvidenskabs-og ingeniør Forskningsråd (NSERC), der operer med tilskud til P.J.U.

1. klargøring af reagenserne
<ol><li>
1-biotin-postfarvnings opløsning (gel-farvnings opløsning)
	<ol>
<li>1 L af 1 M fosfatbuffer ved pH 7,2 ved 25 °C tilføjes 342 mL af 1 M na2HPO4 og 158 ml 1 m Nah2po4. PH justeres til 7,2 ved 50 mM ved tilsætning af den relevante fosfat opløsning. Steril filter ved hjælp af et 0,2 μm filter og opbevar opløsningen i plasticware ved stuetemperatur.</li>
		<li>Klargør 5x gel-Farvningsopløsningen (uden 1-biotin) s...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

En væsentlig fordel ved mango fluorescerende tag er, at et enkelt tag kan bruges på flere måder. Den høje lysstyrke og affinitet af disse aptamers gør dem nyttige ikke kun for i celle visualisering2 , men også for in vitro-RNA eller RNP rensning4. Derfor, gel Imaging udvider alsidigheden af mango tag på en enkel måde. Følsomhed for mango gel-billeddiagnostik er lidt mindre end en nordlige blot14 , men kan nemt detektere 60 – 120 fmol af RN...

Mango er et RNA-mærkningssystem bestående af et sæt af fire små fluorescerende RNA-aptamatorer, der binder stramt (nanomolær binding) til simple derivater af thiazol-orange (1,2,3, figur 1a) . Ved binding, fluorescens af denne ligand er øget 1.000-til 4.000-fold afhængigt af den specifikke aptamer. Den høje lysstyrke af mango-systemet, som for mango III overstiger, at den forstærkede grønne fluorescerende protein (eGFP), kombineret med den nanomolære bindende affinitet af RNA mango aptamers, gør det muligt at blive brugt både i billeddannelse og rensning af RNA komplekser2,4.
Røntgen strukturen af mango I5, II6og III7 er blevet fastlagt til høj opløsning, og alle tre aptamers udnytter et RNA Firplex til bind 1-biotin (figur 1b– D). De kompakte kerner af alle tre aptamers isoleres fra den eksterne RNA-sekvens via kompakte adapter motiver. Mango I og II udnytter begge en fleksibel GNRA-lignende loop-adapter til at forbinde deres mango kerner med en vilkårlig RNA-dupleks (figur 1b, C). I modsætning hertil bruger mango III en stiv Triplex motiv til at forbinde sin kerne til en vilkårlig RNA Helix (figur 1d, lilla rester), mens strukturen af mango IV er ikke i øjeblikket kendt. Da den ligand-bindende kerne af hver af disse aptamers er adskilt fra den eksterne RNA sekvens af disse spiralformede adaptere, det forekommer sandsynligt, at de alle kan blot indarbejdes i en række RNAs. Bakterien 6s regulerende RNA (mango i), komponenter af gær spliceosome (mango i), og human 5s RNA, U6 RNA, og en C/D scarna (mango II og IV) er alle blevet mærket på denne måde2,8, hvilket tyder på, at mange biologiske RNA'er kan mærkes ved hjælp af RNA mango aptamer systemet.
Denaturering og indfødte geler er almindeligt anvendt til at studere RNAs. Denaturerings geler bruges ofte til at bedømme RNA-størrelse eller RNA-behandling, men typisk, i tilfælde af en nordlige blot, for eksempel, kræver flere langsomme og sekventielle trin for at generere et billede. Mens andre RNA-fluorogene aptamatorer, såsom RNA spinach og broccoli, har været anvendt med succes for gel Imaging9, ingen fluorogen aptamer system til dato besidder den høje lysstyrke og affinitet af mango-systemet, hvilket gør det af betydelig interesse at undersøge Mango's gel-Imaging evner. I denne undersøgelse, vi spekulerede på, om RNA mango system kunne simpelthen udvides til gel billeddannelse, som excitation og emission bølgelængder af 1-biotin (510 nm og 535 nm, henholdsvis) er passende for billeddannelse i eGFP kanal fælles for de fleste fluorescerende af gel-scannings instrumentering.
Post-gel farvning protokol præsenteret her giver en hurtig måde at specifikt detektere mango-mærkede RNA molekyler i native og denaturering polyacrylamid gel elektroforese (PAGE) geler. Denne farvning metode involverer iblødsætning geler i en buffer, der indeholder kalium og til1-biotin. RNA mango aptamers er G-firplex baseret og kalium er nødvendig for at stabilisere sådanne strukturer. Ved hjælp af RNA transkriberet fra minimal mango-kodning DNA-skabeloner (Se protokol afsnittet), kan vi simpelthen opdage så lidt som 62,5 fmol af RNA i native geler og 125 fmol af RNA i Denaturerings geler, ved hjælp af en ligetil farvning protokol. I modsætning til almindelige uspecifikke nukleinsyre pletter (Se tabel over materialer, henvist til SG fra hereon), kan vi tydeligt identificere mango-mærkede RNA, selv når høje koncentrationer af total ukodet RNA er til stede i prøven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

Native-og Denaturerings-polyacrylamidgeler anvendes rutinemæssigt til at karakterisere den komplekse mobilitet af ribonucleoprotein (RNP) og til at måle RNA-størrelsen. Da mange gel-Imaging teknikker bruger uspecifikke pletter eller dyre fluorophore sonder, følsomme, diskriminerende, og økonomiske gel-Imaging metoder er meget ønskværdigt. RNA mango Core sekvenser er små (19 – 22 NT) sekvens motiver, der, når de lukkes af en vilkårlig RNA-stamme, kan være ganske enkelt og billigt knyttet til et RNA af interesse. Disse mango Tags binde med høj affinitet og specificitet til en thiazol-orange fluorophore ligand kaldet TIL1-biotin, som bliver tusinder af gange mere fluorescerende på binding. Her viser vi, at mango I, II, III, og IV kan bruges til specifikt billede RNA i geler med høj følsomhed. Så lidt som 62,5 fmol af RNA i native geler og 125 fmol af RNA i Denaturerings geler kan påvises ved iblødsætning geler i en billedbehandlings buffer indeholdende kalium og 20 Nm til1-biotin i 30 min. Vi demonstrerer specificiteten af mango-mærkede system ved at afbilde en mango-Tagged 6S bakteriel RNA i forbindelse med en kompleks blanding af total bakteriel RNA.

Korte mango-mærkede RNAs blev udarbejdet som beskrevet i protokol afsnittet. Antages det, at fluorescens i Denaturerings betingelser ville være mest vanskeligt at observere på grund af tilstedeværelsen af urinstof i geler, vi først undersøgt modstanden af mango aptamerer til urinstof, der fungerer som en nukleinsyre denaturerende. Vi fandt, at mango aptamers er væsentligt modstandsdygtige over for denaturering op til en urea koncentration på ca. 1 M (figur 2a). F?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Her præsenterer vi en følsom, hurtig og diskriminerende post-gel farvning metode til billede RNAs mærket med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, ved hjælp af enten indfødte eller denaturerende polyacrylamid gel elektroforese (PAGE) gels. Efter at have kørt standard side gels, mango-Tagged RNA kan let farves med TIL1-biotin og derefter analyseres ved hjælp af almindeligt tilgængelige fluorescens læsere.

Fluorescerende visualisering af mango-Tagged RNA i polyacrylamid gels via en Poststaining metode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Den Mango-mærkede gelbilleddannelsesmetode, der er påvist her, er robust og forventes at kunne blot udvides med hensyn til følsomhed og specificitet. Dette vil yderligere forenkle den rutinemæssige rensning af biologisk vigtige RNA'er og RNA-komplekser ved den simple hensigtsmæssige at tilføje en Mango-tag til RNA af interesse. RNAs bliver involveret i flere og flere sygdomme derfor dette indlæg dating metode er en nem og hurtig måde at være i stand til at spore og visualisere RNA.Ekstra pleje vil være påkrævet i at overføre gel fra et sted til et andet, da gelerne er skrøbelige og tilbøjelige til at bryde. For at forberede en 30 milliliter denatureringsgel skal du først vælge polyacryamidprocenten med de relevante Bromophenolblå og xylencyanolfarvestoffer sammenlignet med et RNA af interesse for at sikre høj båndseparation. Derefter blandes opløsningerne A, B og C i henhold til tabel et, og tilføj APS og timud.Hæld straks gelopløsningen i et passende gelstøbningsapparat. Sæt den ønskede kegle i og lad gelen blive polymerase i ca. 30 minutter. Geltanken fyldes op med 1 XTBE-opløsning, og keglen fjernes forsigtigt.Løft forsigtigt gelen op og monter den på gelapparatet og fastgør det ved hjælp af bindemiddelclips. Brug en sprøjte til at aspirere brøndene ud umiddelbart før prøvebelastningen. Forbered 1X RNA-prøver ved at tilføje 2X denatureringsgelbelastningsopløsning til de RNA-prøver af interesse.Brug en termocyr til at opvarme prøverne ved 95 grader Celsius i fem minutter. Derefter indlæse afkølede prøver til bunden af hver brønd ved hjælp af gel loading tips. Og godt gelen ved stuetemperatur sikre, at strømmen er effektivt lav til ikke at knække glaspladen af gel apparat.Forbered 1X gel farvning løsning i henhold til manuskriptet i en ren glasbeholder, der er bred nok til komfortabelt at passe gelen. Tilsæt nok 1X gel farvningsopløsning til beholderen, så gelen er helt dækket med opløsningen, når den placeres på en orbital rotator. Når gelen er færdig med at køre, skal du fjerne gelen fra apparatet, afskære dens brønde og et hjørne af gelen for at hjælpe med at bestemme retningen.Derefter forsigtigt overføre gelen i 1X gel farvning løsning. For at udføre billeddannelsen dekanteres hårfarvningsopløsningen omhyggeligt, og gelen skylles hurtigt med vand. Endelig skal du forsigtigt overføre gelen til den bakke, der skal placeres i imageren.Rul en glaspipette over gelen for at fjerne fanget bobler og overskydende væske. Og fortsæt med at tage et gelbillede. Mango aptamers en, to, tre, fire var væsentligt modstå denaturering op til ca. en molar Urea koncentration.20 til 40 minutters farvning tid var tilstrækkelig til maksimal gel florescence. Længere tid var ikke egnet til små RNA'er, der blev anvendt i denne undersøgelse, da de begyndte at sprede sig ud af gelen. Fluorometer analyse viste, at Mango aptamers en, to og tre i overværelse af Urea kunne folde hurtigere end aptamer fire.I mangel af Urea var foldning meget hurtigere som forventet. Følsomheden af stillingen farvning metode blev vist ved enkeltbånd svarende til godt foldede RNA'er for hver af de Mango varianter i indfødte og denaturering geler med en lidt mindre følsomhed for den senere. Kvantificering af indfødte geler var log lineær over omkring en størrelsesorden med Mango en, to og fire opfører sig på en mere lineær måde end Mango tre.Kvantificering af denatureringsgeler var mere lineær, hvilket tydede på, at tilstedeværelsen af Urinstof i denatureringsgelen kunne give en mere homogen måde at folde aptamerne på, når de er placeret i TO1 biotinfarvningsopløsningen. Mango mærkede RNA'er kan påvises ved tilstedeværelse af total RNA ved hjælp af TO1 biotinfarvning sammenlignet med SG-farvning. Husk at sikre, at gelfarvningsbeholderen er stor nok til at passe gelen, ellers kan gelen foldes på sig selv.RNA-prøverne overføres fra et sted til et andet. Svarende til denaturering geler, kan denne metode udføres for en indfødt gel. Kør gelen i et koldt rum ved en lavere effekt for at opretholde indfødte forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode til måling af RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ændringer i celler og væv

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode til isolering af stærkt Renset RNA fra Frø til brug i Kvantitative Transkriptomet Analysis

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Påvisning og visualisering af DNA-skader-inducerede proteinkomplekser i suspensionscellekulturer ved anvendelse af Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetriske metode til måling af jernindhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse af oversættelse indledningen kompleks dannelse på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Hurtig og omkostningseffektiv RNA udvinding af rotte pancreas væv

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...