Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

De auteurs bedanken Razvan Jelliii en Amir Abdolahzadeh voor hun technische bijstand en Lena Dolgosheina voor het proeflezen van het manuscript. De financiering werd verstrekt voor dit project door een Canadese natuurwetenschappen en ingenieurs Onderzoekraad (NSERC) exploitatiesubsidie aan P.J.U.

1. voorbereiding van de reagentia
<ol><li>
TOT1-Biotine poststaining oplossing (gel kleuring oplossing)
	<ol>
<li>Maak 1 L van 1 M fosfaatbuffer bij pH 7,2 bij 25 °C door 342 mL van 1 M na2HPO4 en 158 ml van 1 m Nah2po4toe te voegen. Pas pH aan 7,2 bij 50 mM aan door de aangewezen fosfaat oplossing toe te voegen. Steriel-filter met behulp van een 0,2 µm filter en bewaar de oplossing in plasticware bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Bereid 5x gel kleuring oplo...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

Een belangrijk voordeel van de mango fluorescerende tag is dat een enkele tag kan worden gebruikt op meerdere manieren. De hoge helderheid en de affiniteit van deze aptameren maken hen nuttig niet alleen voor in cel visualisatie2 maar ook voor in vitro RNA of RNP zuivering4. Daarom, gel Imaging breidt de veelzijdigheid van de mango-tag op een eenvoudige manier. Mango gel Imaging gevoeligheid is iets minder dan die van een noordelijke vlek14 , maar ka...

Mango is een RNA-tagging systeem bestaande uit een set van vier kleine fluorescerende RNA aptameren die stevig binden (nanomolar binding) aan eenvoudige derivaten van de Thiazole-Orange (TOT1-biotine, Figuur 1a)1,2,3 . Bij het binden wordt de fluorescentie van dit ligand verhoogd 1.000-naar 4.000-voudig afhankelijk van de specifieke aptamer. De hoge helderheid van het mango systeem, dat voor Mango III dat van verbeterde groene fluorescente proteïne (eGFP) overschrijdt, combineerde met de nanomolar bindende affiniteit van de mango aptameren van RNA, laat het toe om zowel in de beeldvorming als de reiniging van RNA worden gebruikt complexen2,4.
De X-Ray structuren van mango I5, II6, en III7 zijn bepaald aan hoge resolutie, en alle drie APTAMEREN gebruiken een RNA quadruplex om tot1-Biotine (Figuur 1b– D) te binden. De compacte kernen van alle drie de aptameren zijn geïsoleerd van de externe RNA sequentie via compacte adapter motieven. Mango I en II maken beide gebruik van een flexibele GNRA-achtige lus adapter om hun mango kernen aan te sluiten op een willekeurige RNA duplex (Figuur 1b, C). In tegenstelling, mango III maakt gebruik van een rigide triplex motief om de kern te verbinden met een willekeurige Helix (figuur 1d, paarse residuen), terwijl de structuur van de mango IV is momenteel niet bekend. Aangezien de ligand-bindende kern van elk van deze aptameren van de externe opeenvolging van RNA door deze spiraalvormige adapters wordt gescheiden, schijnt het waarschijnlijk dat zij allen eenvoudig in een verscheidenheid van ASE kunnen worden opgenomen. De bacteriële 6s Regulatory RNA (Mango i), componenten van de gist spliceosoom (Mango i), en de menselijke 5s RNA, U6 RNA, en een C/D scaRNA (Mango II en IV) zijn allemaal met succes gecodeerd in deze mode2,8, wat suggereert dat veel biologische ASE kan worden gelabeld met behulp van de RNA mango aptamer systeem.
Het denatureren en de inheemse gels worden algemeen gebruikt om ASE te bestuderen. Het denatureren gels worden vaak gebruikt om de grootte van RNA of de verwerking van RNA te beoordelen, maar typisch, in het geval van een noordelijke vlek, bijvoorbeeld, vereis verscheidene langzame en opeenvolgende stappen om een beeld te produceren. Terwijl andere RNA fluorogenic aptameren, zoals RNA spinazie en broccoli, zijn met succes gebruikt voor gel Imaging9, geen fluorogenic aptamer systeem tot op heden beschikt over de hoge helderheid en affiniteit van de mango-systeem, waardoor het van aanzienlijk belang om te onderzoeken mango gel-Imaging capaciteiten. In deze studie, vroegen we ons af of de RNA mango systeem kan eenvoudig worden uitgebreid tot gel beeldvorming, zoals de excitatie en emissie golflengten van TOT1-Biotine (510 Nm en 535 nm, respectievelijk) zijn geschikt voorbeeld vorming in de eGFP kanaal gemeenschappelijke voor de meeste fluorescerende gel-Scanning instrumentatie.
De post-gel kleuring protocol hier gepresenteerd biedt een snelle manier om specifiek te detecteren mango-gecodeerde RNA-moleculen in native en denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Deze kleuring methode omvat weken gels in een buffer met kalium en TOT1-biotine. RNA mango aptameren zijn G-quadruplex gebaseerd en kalium is nodig om dergelijke structuren te stabiliseren. Gebruikend RNA dat van minimale mango-codeert de malplaatjes van DNA wordt getranscribeerd (Zie de sectie van het Protocol), kunnen wij eenvoudig zo weinig zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels ontdekken, gebruikend een ongecompliceerd Protocol van de kleuring. In tegenstelling tot gemeenschappelijke niet-specifieke Nucleic zure vlekken (Zie lijst van materialen, die naar SG van hierop wordt verwezen), kunnen wij mango-geëtiketteerde RNA duidelijk identificeren zelfs wanneer de hoge concentraties van totaal untagged RNA in de steekproef aanwezig zijn.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

Native en denaturerende Polyacrylamide gels worden routinematig gebruikt om ribonucleoproteã (RNP) complexe mobiliteit te karakteriseren en de grootte van RNA te meten, respectievelijk. Zoals veel gel-Imaging technieken gebruiken niet-specifieke vlekken of dure fluorophore sondes, gevoelige, discriminerende, en economische gel-Imaging methodologieën zijn zeer wenselijk. De de kern opeenvolgingen van RNA mango zijn kleine (19-22 NT) opeenvolgings motieven die, wanneer gesloten door een willekeurige Steel van RNA, eenvoudig en goedkoop aan een RNA van belang kunnen worden toegevoegd. Deze mango Tags binden met een hoge affiniteit en specificiteit van een Thiazole-Orange fluorophore ligand genaamd TOT1-biotine, die wordt duizenden malen meer fluorescerende op bindend. Hier laten we zien dat mango I, II, III, en IV kan worden gebruikt om specifiek beeld RNA in gels met een hoge gevoeligheid. Zo weinig zoals 62,5 fmol van RNA in inheemse gels en 125 fmol van RNA in het denatureren gels kan worden ontdekt door het weken gels in een beeldvormings buffer die kalium en 20 nM TOT1-Biotine voor 30 min bevat. We tonen de specificiteit van de mango-Tagged systeem door Imaging een mango-gecodeerde 6S bacteriële RNA in de context van een complex mengsel van totale bacteriële RNA.

Korte mango-Tagged ASE werden voorbereid zoals beschreven in het protocol sectie. Ervan uitgaande dat de fluorescentie in de denaturering omstandigheden het meest moeilijk te observeren als gevolg van de aanwezigheid van ureum in de gels, we eerst bestudeerde de weerstand van de mango aptameren aan ureum, die fungeert als een nucleïnezuur denaturaat. We vonden dat mango aptameren aanzienlijk resistent zijn tegen denaturatie tot een ureum concentratie van ongeveer 1 M (Figuur 2a</...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Hier presenteren we een gevoelige, snelle en discriminerende post-gel kleuring methode om image-ASE Tagged met RNA mango aptameren I, II, III, of IV, met behulp van een native of denaturerende Polyacrylamide gel elektroforese (pagina) gels. Na het runnen van standaard pagina gels, mango-gecodeerde RNA kan gemakkelijk worden gekleurd met TOT1-Biotine en vervolgens geanalyseerd met behulp van de meest beschikbare fluorescentie lezers.

Fluorescerende visualisatie van mango-Tagged RNA in Polyacrylamide gels via een Poststaining methode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

De Mango-tagged gel imaging methodologie die hier is aangetoond is robuust en zal naar verwachting eenvoudig kunnen worden uitgebreid in termen van gevoeligheid en specificiteit. Dit zou de routinematige zuivering van biologisch belangrijke RNAs- en RNA-complexen verder vereenvoudigen door eenvoudig een Mango-tag toe te voegen aan het RNA van belang. RNAs worden betrokken bij meer en meer ziekten daarom deze post dating methode is een gemakkelijke en snelle manier om te kunnen volgen en visualiseren RNA.Extra zorg zal nodig zijn bij de overdracht van de gel van de ene plaats naar de andere als de gels zijn kwetsbaar en gevoelig voor breken. Om een 30 milliliter denatureringsgel voor te bereiden, selecteert u eerst het polyacrylamidepercentage met het juiste Bromophenolblauw en xylene cyanolkleurstoffen in vergelijking met een RNA van belang om een hoge bandscheiding te verzekeren. Meng vervolgens oplossingen A, B en C volgens tabel één en voeg APS en timud toe.Giet de geloplossing onmiddellijk in een geschikt gelgietapparaat. Steek de gewenste kegel en laat de gel ongeveer 30 minuten aan polymerase. Maak de geltank aan met 1 XTBE-oplossing en verwijder de kegel voorzichtig.Til de gel voorzichtig op en monteer op het gelapparaat en bevestig met bindmiddelclips. Met behulp van een spuit, aspirate uit de putten onmiddellijk voorafgaand aan monster laden. Bereid 1x RNA monsters door 2x denatureren gel laden oplossing toe te voegen aan de RNA monsters van belang.Gebruik een thermocycler om de monsters te verwarmen op 95 graden Celsius gedurende vijf minuten. Laad vervolgens gekoelde monsters naar de bodem van elke put met behulp van gel laden tips. En goed de gel bij kamertemperatuur ervoor te zorgen dat de macht effectief laag is om niet te kraken de glasplaat van de gel apparaat.Bereid 1X gel kleuring oplossing volgens het manuscript in een schone glazen container die breed genoeg is om comfortabel te passen in de gel. Voeg voldoende 1X gel kleuring oplossing aan de container, zodat de gel volledig is bedekt met de oplossing wanneer het wordt geplaatst op een orbitale rotator. Zodra de gel klaar is met lopen, verwijder de gel uit het apparaat, snijd de putten ervan af, en een hoek van de gel om de oriëntatie te helpen bepalen.Breng de gel vervolgens voorzichtig over in de 1X gel kleuroplossing. Om de beeldvorming uit te voeren, voorzichtig decanteren van de kleuroplossing en spoel de gel snel met water. Breng ten slotte de gel voorzichtig over op de lade die in de afbeeldingsreger moet worden geplaatst.Rol een glazen pipet over de gel om gevangen bellen en overtollige vloeistof te verwijderen. En ga over tot het nemen van een gel beeld. Mango aptamers één, twee, drie, vier waren wezenlijk weerstaan aan denaturatie tot ongeveer één kiesconcentratie Ureum.20 tot 40 minuten kleuringstijd was voldoende voor maximale gel florescentie. Langere tijd was niet geschikt voor kleine RNAs gebruikt in deze studie als ze begonnen te verspreiden uit de gel. Fluorometer analyse toonde aan dat Mango aptamers een, twee en drie in aanwezigheid van Ureum sneller kon vouwen dan aptamer vier.Bij afwezigheid van Ureum ging het vouwen veel sneller dan verwacht. De gevoeligheid van de post kleuring methode werd getoond door enkele banden die overeenkomen met goed gevouwen RNAs voor elk van de Mango varianten in inheemse en denatureren gels met een iets minder gevoeligheid voor de latere. Kwantificering van inheemse gels was log lineair over ongeveer een orde van grootte met Mango een, twee, en vier gedragen zich in een meer lineaire manier dan Mango drie.Kwantificering van denatureringsgels waren meer lineair, wat suggereert dat de aanwezigheid van Ureum in de denatureringsgel een meer homogene manier zou kunnen bieden om de aptamers te vouwen zodra ze in de TO1 biotine kleuroplossing zijn geplaatst. Mango gelabelde RNAs kan worden gedetecteerd in de aanwezigheid van de totale RNA met behulp van TO1 biotine vlekken in vergelijking met SG kleuring. Vergeet niet om ervoor te zorgen dat de gel kleuring container is groot genoeg om de gel passen anders de gel kan vouwen op zichzelf.De RNA-monsters worden van de ene plaats naar de andere overgebracht. Net als bij de denatureringsgels kan deze methode worden uitgevoerd voor een inheemse gel. Voer de gel in een koude kamer op een lager wattage om inheemse omstandigheden te handhaven.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Een methode voor het meten van RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Wijzigingen in cellen en weefsels

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Een colorimetrische methode voor het meten van ijzergehalte in planten

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snelle en kosteneffectieve RNA-extractie van rattenlelfum

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...