Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

המחברים מודים לרזון קוג'ואו ואמיר אבדולאזדה על הסיוע הטכני שלהם ועל לנה דולגושינה על הגהה של כתב היד. המימון סופק עבור פרויקט זה על ידי מדעי הטבע הקנדי ומועצת המחקר ההנדסה (NSERC) מענק הפעלה P.J.U.

1. הכנת הריאגנטים
<ol><li>
TO1-ביוטין הפתרון החותמות (ג'ל צביעת פתרון)
	<ol>
<li>לעשות 1 L של 1 מטר מאגר פוספט ב-pH 7.2 בגובה 25 ° c על ידי הוספת 342 mL של 1 M של Na2hpo4 ו 158 ML של 1 m נה2PO4. להתאים את ה-pH ל 7.2 ב 50 mM על ידי הוספת פתרון פוספט מתאים. מסנן סטרילי באמצעות מסנן 0.2 יקרומטר ואחסן את ?...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

יתרון משמעותי של תג פלורסנט מנגו הוא תג אחד ניתן להשתמש בדרכים מרובות. בהירות גבוהה ואהדה של aptamers אלה להפוך אותם שימושיים לא רק עבור הדמיית תא2 אלא גם עבור מחוץ גופית RNA או rnp טיהור4. לכן, הדמיה ג'ל מרחיב את רב-תכליתיות תג מנגו בצורה פשוטה. רגישות מנגו ג'ל הדמיה היא מעט...

מנגו הוא מערכת תיוג RNA המורכב מסדרה של ארבעה RNA פלורסנט קטנים aptamers לאגד בחוזקה (כריכת nanomolar) כדי נגזרות פשוטות של thiazole-כתום (TO1-Biotin, איור 1A)1,2,3 . עם הכריכה, הקרינה הפלואורסצנטית של זה הוא גדל 1,000-to 4,000-לקפל בהתאם לאפאלף המסוים. בהירות גבוהה של מערכת מנגו, אשר עבור מנגו III עולה על זה של חלבון פלורסנט ירוק משופר (eGFP), בשילוב עם הזיקה של האיגוד nanomolar של ה-RNA מנגו aptamers, מאפשר לו לשמש הן הדמיה וטיהור של RNA תסביכים2,4.
רנטגן מבנים של מנגו אני5, השני6, ו III7 היו נחושים ברזולוציה גבוהה, וכל שלושת Aptamers לנצל את ה-RNA 4 מ א כדי לאגד TO1-biotin (איור 1b– D). הליבות הקומפקטיות של כל שלושת האפתמים מבודדים מרצף ה-RNA החיצוני באמצעות מוטיבים מתאם קומפקטיים. מנגו I ו-II לנצל מתאם גמישה GNRA כמו לולאה כדי לחבר את ליבות מנגו שלהם לדופלקס RNA שרירותי (איור 1B, C). לעומת זאת, מנגו השלישי משתמש מוטיב טריפלקס נוקשה לחבר את הליבה שלה סליל RNA שרירותי (איור 1D, שאריות סגולים), בעוד המבנה של מנגו IV אינו ידוע כעת. כמו הליבה ליגולי מחייב של כל אחד מהאפתמים האלה מופרד מרצף ה-RNA החיצוני על ידי המתאמים הללו, נראה כי הם יכולים להיות פשוט שולבו מגוון של RNAs. ה-rna התלת-ממדי של החיידק (מנגו i), הרכיבים של השמרים מלצונים (מנגו i), ו-rna 5s, U6 rna, ו-C/D scarna (מנגו II ו IV) כל היתה בהצלחה מתויג באופנה2,8, הרומז כי רבים RNAs ביולוגי יכול להיות מתויג באמצעות RNA מנגו מערכת aptamer.
הרפתקאות מקורי וג משמשים בדרך כלל כדי ללמוד RNAs. ג'לים משומשים משמשים לעתים קרובות כדי לשפוט את הגודל או העיבוד של RNA, אבל בדרך כלל, במקרה של כתם בצפון, למשל, דורשים מספר שלבים איטיים ורציפים כדי ליצור תמונה. בעוד כאשר ה-RNA fluorogenic אחרים, כמו תרד RNA וברוקולי, כבר נעשה שימוש בהצלחה עבור הדמיה ג'ל9, אין מערכת apers fluorogenic עד היום בעל בהירות גבוהה ואהדה של מערכת מנגו, מה שהופך אותו עניין רב לחקור יכולות הדמיה ג'ל של מנגו. במחקר זה, תהינו אם מערכת ה-RNA מנגו יכול להיות פשוט מורחב ג'ל הדמיה, כמו עירור אורכי גל פליטה של TO1-Biotin (510 nm ו 535 nm, בהתאמה) מתאימים הדמיה בערוץ eGFP משותף הפלורסנט ביותר מכשור סריקת ג'ל.
הפרוטוקול שלאחר ג'ל מכתים הציג כאן מספק דרך מהירה במיוחד לזהות מנגו מתויגות מולקולות RNA ב מקורי והרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. זו שיטת הצביעת כוללת ג'ל לטבילה במאגר המכיל אשלגן ו-TO1-Biotin. רנ א מנגו aptamers הם G-ארבעה מבוססי plex ו אשלגן נדרש כדי לייצב מבנים כאלה. באמצעות RNA ששועתק מ מינימלי קידוד מנגו תבניות DNA (לראות את מדור הפרוטוקול), אנחנו יכולים פשוט לזהות מעט ככל 62.5 fmol של RNA ב ג'לים מקומיים ו 125 fmol של RNA ב-הרפתקאות ג ' לים, באמצעות פרוטוקול מכתים ישירה. בניגוד לכתמי חומצות גרעין לא ספציפיות (ראה טבלת חומרים, המכונה SG מכאן), אנחנו יכולים לזהות בבירור מנגו-rna מתויג גם כאשר ריכוזים גבוהים של רנ א מתויג סך קיימים במדגם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

באופן שגרתי ובאמצעות ג'ל פוליאקרילמיד משמשים לאפיון מורכבות של ריבונאופלפרוטאין (RNP) ולמדידת גודל RNA, בהתאמה. כמו שיטות רבות של הדמיה ג'ל להשתמש כתמים לא ספציפיים או בדיקה fluorophore יקר, רגיש, להפלות, ומתודולוגיות הדמיה חסכונית-ג'ל הם רצויים מאוד. RNA רצפי הליבה של מנגו הם קטנים (19-22 nt) רצף מוטיבים כי, כאשר נסגר על ידי גזע שרירותי RNA, יכול להיות פשוט ובזול מצורף ל-RNA של עניין. אלה תגי מנגו לאגד עם אהדה גבוהה וספציפיות thiazole-כתום fluorophore ליגיום הנקרא TO1-Biotin, אשר הופך אלפי פעמים פלורסנט יותר על הכריכה. כאן אנו מראים כי מנגו I, II, III, ו IV יכול לשמש במיוחד בתמונה RNA ב ג'לים עם רגישות גבוהה. קצת כמו 62.5 fmol של RNA ב ג'לים מקומיים ו 125 fmol של RNA בג הרפתקאות ניתן להבחין על ידי ג'ל הטבילה במאגר דימות המכיל אשלגן ו 20 ננומטר TO1-Biotin עבור 30 דקות. אנו להדגים את הספציפיות של מנגו מערכת מתויגים על ידי דימות מנגו-שתייגת ה-RNA בקטריאלי של 6S בהקשר של תערובת מורכבת של רנ א חיידקי הכולל.

קצר מנגו-tagged RNAs הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול. בהנחה כי הזריחה בתנאים denaturing יהיה קשה ביותר להתבונן בשל הנוכחות של אוריאה ב ג'לים, אנו הראשונים לחקור את ההתנגדות של aptamers מנגו כדי אוריאה, אשר משמש חומצה גרעין denaturant. מצאנו aptamers מנגו עמידים באופן משמעותי כדי לגבות את ריכוז אורי...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

כאן אנו מציגים רגיש, מהיר, ומפלה שיטת להפלות מכתים את התמונה rnas מתויג עם ה-RNA מנגו aptamers I, II, III, או IV, באמצעות מקורי או באמצעות הרפתקאות אלקטרופורזה ג'ל אלקטרופורזה (PAGE) ג'לים. לאחר הפעלת ג'לים סטנדרטיים של דף, מנגו-מתויג RNA יכול להיות מוכתם בקלות עם TO1-Biotin ולאחר מכן ניתח באמצעות קוראי קרינה זמינים נפוץ.

הדמיית פלורסנט של מנגו-מתויג RNA ב-Pvc פוליאקרילאמיד באמצעות שיטת Poststaining

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

מתודולוגיית הדמיית הג'ל המתויגת במנגו שהוכח כאן היא חזקה וצפויה להיות מסוגלת פשוט להיות מורחבת מבחינת רגישות וספטיות. זה יהיה עוד יותר לפשט את הטיהור השגרתי של RNAs חשוב ביולוגית קומפלקסים RNA על ידי פשוט יעיל של הוספת תג מנגו ל- RNA של עניין. RNAs להיות מעורב יותר ויותר מחלות זה עבור שיטת היכרויות פוסט זו היא דרך קלה ומהירה כדי להיות מסוגל לעקוב ולדמיין RNA.טיפול נוסף יידרש בהעברת הג'ל ממקום למקום מכיוון שהג'לים שבירים ונוטים להישבר. כדי להכין ג'ל denaturing 30 מיליליטר, בחר תחילה את אחוז פוליאקרילמיד עם כחול ברומופנול המתאים, וצבעי קסילן ציאנול לעומת RNA של עניין לבטח הפרדת פס גבוהה. לאחר מכן, ערבבו פתרונות A, B ו-C לפי לוח 1 והוסיפו APS וטימוד.יוצקים מיד את תסנו הג'ל לתוך מנגנון יציקת ג'ל מתאים. מכניסים את הקונוס הרצוי ומשאירים את הג'ל לפולימראז למשך כ-30 דקות. הפוך את מיכל הג'ל באמצעות פתרון XTBE אחד ולהסיר בזהירות את הקונוס.בזהירות להרים את הג'ל לעלות על מנגנון ג'ל ומאובטח באמצעות קליפים קלסר. באמצעות מזרק, שאף את בארות מיד לפני טעינת מדגם. הכן דגימות RNA 1X על ידי הוספת פתרון טעינת ג'ל denaturing 2X לדגימות RNA של עניין.השתמש תרמוצ'ילר לחמם את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, לטעון דגימות מקורר לתחתית של כל באר באמצעות טיפים טעינת ג'ל. וגם את הג'ל בטמפרטורת החדר להבטיח את הכוח הוא נמוך ביעילות לא לפצח את צלחת הזכוכית של מנגנון הג'ל.הכינו פתרון ויטראז' ג'ל 1X על פי כתב היד במיכל זכוכית נקי רחב מספיק כדי להתאים בנוחות לג'ל. מוסיפים מספיק פתרון 1X ג'ל מכתים את המיכל, כך הג'ל מכוסה לחלוטין עם הפתרון כאשר הוא ממוקם על סיבוב מסלולית. לאחר הג'ל מסיים לרוץ, להסיר את הג'ל מן המנגנון, לחתוך את הבארות שלה, פינה של הג'ל על מנת לעזור לקבוע את הכיוון.לאחר מכן, מעבירים בזהירות את הג'ל לתסיכת הכתמת הג'ל 1X. כדי לבצע את ההדמיה, בזהירות decant פתרון הכתמים ולשטוף את הג'ל במהירות עם מים. לבסוף, בזהירות להעביר את הג'ל על המגש להיות ממוקם בתמונה.מגלגלים פיפיט זכוכית מעל הג'ל כדי להסיר בועות לכודות ונוזל עודף. ולהמשיך לקחת תמונת ג'ל. מנגו aptamers אחד, שתיים, שלוש, ארבע התנגדו באופן משמעותי denaturation עד ריכוז אחד טוחן אוריאה.זמן הכתמה של 20 עד 40 דקות הספיק לפרוח ג'ל מקסימלי. זמן רב יותר לא היה מתאים RNAs קטן בשימוש במחקר זה כפי שהם התחילו להתפזר מתוך הג'ל. ניתוח פלואורומטר הראה כי מנגו aptamers אחד, שתיים, ושלושה בנוכחות אוריאה יכול לקפל מהר יותר מאשר aptamer ארבע.בהיעדר אוריאה, הקיפול היה מהיר בהרבה מהצפוי. הרגישות של שיטת הכתמת הפוסט הוצגה על ידי להקות בודדות המתאימות ל- RNAs מקופלים היטב עבור כל אחת מגרסאות המנגו בג'לים מקוריים ומרוקנים עם מעט פחות רגישות עבור המאוחר יותר. כימות של ג'לים מקומיים היה יומן ליניארי על סדר גודל אחד עם מנגו אחד, שתיים, וארבע מתנהג בצורה ליניארית יותר מאשר מנגו שלוש.כימות של ג'לים denaturing היו ליניאריים יותר מציע כי הנוכחות של אוריאה בג'ל denaturing עשוי לספק דרך הומוגנית יותר לקפל את aptamers ברגע שהם ממוקמים בתתבת הכתמת ביוטין TO1. מנגו מתויג RNAs ניתן לזהות בנוכחות RNA הכולל באמצעות TO1 כתמי ביוטין לעומת כתמי SG. זכור לוודא כי מיכל מכתים ג'ל גדול מספיק כדי להתאים את הג'ל אחרת הג'ל עלול להתקפל על עצמו.דגימות ה-RNA יתעבירו ממקום למקום. בדומה לג'לים denaturing, שיטה זו יכולה להתבצע עבור ג'ל מקומי. הפעל את הג'ל בחדר קר בהספק נמוך יותר כדי לשמור על התנאים המקומיים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

שיטה למדידת RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ&quot;א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

איתור ויזואליזציה של DNA הנזק- Induced חלבון קומפלקסים ההשעיה תא תרבויות באמצעות Assay קשירת הקרבה

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

שיטה ערכי צבע מוחלטים למדידת תכולת ברזל צמחים

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...