Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Forfatterne takker Razvan Cojocaru og Amir Abdolahzadeh for deres tekniske assistanse og Lena Dolgosheina for korrekturlesing av manuskriptet. Finansiering ble gitt for dette prosjektet av en kanadisk naturvitenskap og engineering Research Council (NSERC) drifts stipend til P.J.U.

1. fremstilling av reagensene
<ol><li>
TO1-biotin poststaining oppløsning (gel farge løsning)
	<ol>
<li>Lag 1 L av 1 M fosfat buffer ved pH 7,2 ved 25 ° c ved å tilsette 342 mL 1 M av na2HPO4 og 158 ml 1 m NaH2PO4. Juster pH til 7,2 ved 50 mM ved å tilsette den aktuelle fosfat oppløsningen. Sterilt filter ved hjelp av et 0,2 μm filter og oppbevar oppløsningen i plasticware ved romtemperatur.</li>
		<li>Klargjør 5x farge løsning for gel (uten TO1-bio...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

En betydelig fordel med mango fluorescerende koden er at en enkelt kode kan brukes på flere måter. Den høye lysstyrken og affinitet av disse aptamers gjøre dem nyttige ikke bare for i celle visualisering2 , men også for in vitro RNA eller RNP rensing4. Derfor utvider gel Imaging allsidigheten til mango-taggen på en enkel måte. Mango gel Imaging følsomhet er litt mindre enn en nordlig blot14 men kan lett oppdage 60-120 FMOL av RNA prøve, uten...

Mango er en RNA merking system bestående av et sett av fire små fluorescerende RNA aptamers som binder tett (nanomolar binding) til enkle derivater av tiazol-Orange (TO1-biotin, figur 1a)1,2,3 . Ved binding økes fluorescens av denne ligand 1 000-til 4 000-fold avhengig av den spesifikke aptamer. Den høye lysstyrken til mango-systemet, som for mango III overstiger det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (eGFP), kombinert med nanomolar bindende affinitet til RNA mango-aptamers, gjør at den kan brukes både i bildebehandling og ved rensing av RNA komplekser2,4.
X-ray-strukturene til mango I5, II6og III7 har blitt bestemt til høy oppløsning, og alle tre aptamers bruker en RNA-quadrapleksbilder til å binde TO1-biotin (figur 1B– D). De kompakte kjernene av alle tre aptamers er isolert fra den eksterne RNA-sekvensen via kompakte adapter motiver. Både mango I og II benytter en fleksibel GNRA-lignende sløyfe adapter for å koble sine mango kjerner til en vilkårlig RNA duplex (figur 1B, C). I kontrast, bruker mango III en stiv triplex motiv for å koble sin kjerne til en vilkårlig RNA Helix (figur 1d, lilla rester), mens strukturen i mango IV er foreløpig ikke kjent. Siden den ligand kjernen i hver av disse aptamers er adskilt fra den eksterne RNA-sekvensen av disse spiral adapterne, synes det sannsynlig at de alle kan enkelt innlemmes i en rekke RNAs. Den bakterielle 6s regulatoriske RNA (mango i), komponenter av gjær spliceosome (mango i), og den menneskelige 5s RNA, U6 RNA, og en C/D scaRNA (mango II og IV) har alle blitt tagget i denne moten2,8, noe som tyder på at mange biologiske RNAs kan merkes med RNA mango aptamer-systemet.
Denaturering og Native gels brukes ofte til å studere RNAs. Denaturering gels brukes ofte til å bedømme RNA størrelse eller RNA prosessering, men vanligvis, i tilfelle av en nordlig blot, for eksempel, krever flere langsomme og sekvensielle trinn for å generere et bilde. Mens andre RNA fluorogenic aptamers, slik som RNA spinat og brokkoli, har vært brukt med hell for gel Imaging9, no fluorogenic aptamer system hittil besitter høylys styrke og affinitet av mango-systemet, noe som gjør det av stor interesse å undersøke mango ' s gel-Imaging evner. I denne studien lurte vi på om RNA mango-systemet bare kunne utvides til gel Imaging, ettersom eksitasjon-og utslipps bølgelengdene til TO1-biotin (henholdsvis 510 NM og 535 NM) er egnet for bildebehandling i eGFP-kanalen som er felles for de fleste fluorescerende instrumenter for gel skanning.
Den post-gel farging protokollen som presenteres her gir en rask måte å spesifikt oppdage mango-Tagged RNA molekyler i native og denaturering polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) gels. Denne farge metoden innebærer soaking gels i en buffer som inneholder kalium og TO1-biotin. RNA mango aptamers er G-quadrapleksbilder basert og kalium er nødvendig for å stabilisere slike strukturer. Ved hjelp av RNA transkribere fra minimale mango-koding DNA maler (se protokollen delen), kan vi bare oppdage så lite som 62,5 fmol av RNA i native gels og 125 fmol av RNA i denaturering gels, ved hjelp av en enkel fargeprotokoll. I motsetning til vanlige uspesifisert nukleinsyre yre flekker (se tabell over materialer, referert til SG fra heretter), kan vi tydelig identifisere mango-Tagged RNA selv når høye konsentrasjoner av totalt umerkede RNA er til stede i prøven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

Native og denaturering polyakrylamid gels brukes rutinemessig til å karakterisere ribonucleoprotein (RNP) kompleks mobilitet og å måle RNA størrelse, henholdsvis. Så mange gel-Imaging teknikker bruke spesifikke flekker eller dyre fluoroforen sonder, følsom, diskriminerende, og økonomiske gel-Imaging metoder er svært ønskelig. RNA mango kjerne sekvenser er små (19 – 22 NT) sekvens motiver som, når de er lukket av en vilkårlig RNA-stamme, kan enkelt og rimelig legges til en RNA av interesse. Disse mango Tags binder med høy affinitet og spesifisitet til en tiazol-oransje fluoroforen ligand kalt TO1-biotin, som blir tusenvis av ganger mer fluorescerende ved binding. Her viser vi at mango i, II, III, og IV kan brukes til spesielt bilde RNA i gels med høy følsomhet. Så lite som 62,5 fmol av RNA i native gels og 125 fmol av RNA i denaturering gels kan oppdages ved soaking gels i en avbildnings buffer som inneholder kalium og 20 nM TO1-biotin i 30 min. Vi demonstrerer spesifisitet av det mango-kodede systemet ved å avbilde en mango-Tagged 6S bakteriell RNA i sammenheng med en kompleks blanding av total bakteriell RNA.

Kort mango-Tagged RNAs ble utarbeidet som beskrevet i protokollen delen. Forutsatt at fluorescens i denaturering forhold ville være mest vanskelig å observere på grunn av tilstedeværelsen av urea i gels, vi først studerte motstanden av mango aptamers til urea, som fungerer som en nukleinsyre acid denaturant. Vi fant ut at mango aptamers er vesentlig motstandsdyktig mot denaturering opp til en urea konsentrasjon på ca 1 M (figur 2a). Før du legger gel farge løsning...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Her presenterer vi en følsom, rask, og diskriminerende post-gel Fargemetode til bilde RNAs tagget med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, ved hjelp av enten native eller denaturering polyakrylamid gel elektroforese (PAGE) gels. Etter å ha kjørt standard PAGE gels, kan mango-Tagged RNA enkelt farget med TO1-biotin og deretter analyseres ved hjelp av allment tilgjengelige fluorescens lesere.

Fluorescerende visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamid gels via en Poststaining metode

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Den Mango-merkede gelavbildningsmetodikken som er demonstrert her, er robust og forventes å kunne bare utvides når det gjelder følsomhet og spesifisitet. Dette vil ytterligere forenkle den rutinemessige rensingen av biologisk viktige RNA-komplekser og RNA-komplekser ved den enkle hensiktsmessigheten av å legge til en Mango-tag til RNA av interesse. RNAs blir innblandet i flere og flere sykdommer derfor dette innlegget dating metoden er en enkel og rask måte å kunne spore og visualisere RNA.Ekstra forsiktighet vil være nødvendig i å overføre gelen fra ett sted til et annet som gelene er skjøre og utsatt for å bryte. For å forberede en 30 milliliter denaturing gel, først velge polyakrylamid prosent med riktig Bromophenol blå, og xylen cyanol fargestoffer sammenlignet med en RNA av interesse for å sikre høy bånd separasjon. Deretter blander du løsninger A, B og C i henhold til tabell én og legger til APS og timud.Hell umiddelbart geloppløsningen i et passende gelstøpeapparat. Sett inn ønsket kjegle og la gelen polymerase i ca. 30 minutter. Lag geltanken ved hjelp av 1 XTBE-løsning og fjern forsiktig kjeglen.Løft gelen forsiktig opp og monter på gelapparatet og fest med binderklemmer. Bruk en sprøyte til å aspirere ut brønnene umiddelbart før prøvelasting. Forbered 1X RNA-prøver ved å legge til 2X denaturing gel lasting løsning til RNA prøver av interesse.Bruk en termocycler til å varme prøvene ved 95 grader Celsius i fem minutter. Deretter laster du avkjølte prøver til bunnen av hver brønn ved hjelp av gellastetips. Og vel gelen ved romtemperatur som sikrer at strømmen er effektivt lav for å ikke knekke glassplaten til gelapparatet.Forbered 1X gelfargingsløsning i henhold til manuskriptet i en ren glassbeholder som er bred nok til å passe gelen komfortabelt. Tilsett nok 1X gelfargingsløsning i beholderen slik at gelen er helt dekket med løsningen når den er plassert på en orbital rotator. Når gelen er ferdig med å gå, fjern gelen fra apparatet, kutt av sine'brønner og et hjørne av gelen for å bestemme orienteringen.Deretter overfører du gelen forsiktig til 1X gelfargingsløsningen. For å utføre bildet, dekanter forsiktig fargingsoppløsningen og skyll gelen raskt med vann. Til slutt, forsiktig overføre gelen på skuffen som skal plasseres i imager.Rull en glasspipette over gelen for å fjerne fanget bobler og overflødig væske. Og fortsett å ta et gelbilde. Mango aptamers en, to, tre, fire var vesentlig motstå å denaturation opp til omtrent en molar Urea konsentrasjon.20 til 40 minutters fargingstid var tilstrekkelig for maksimal gel florescence. Lengre tid var ikke egnet for små RNAs som brukes i denne studien da de begynte å spre seg ut av gelen. Fluorometeranalyse viste at Mango aptamers en, to og tre i nærvær av Urea kunne kaste raskere enn aptamer fire.I fravær av Urea var folding mye raskere som forventet. Følsomheten til postfargingsmetoden ble vist av enkeltbånd som tilsvarer godt brettede RNA-er for hver av Mango-variantene i innfødte og denaturing geler med litt mindre følsomhet for den senere. Kvantifisering av innfødte geler var log lineær over omtrent en størrelsesorden med Mango en, to og fire oppfører seg på en mer lineær måte enn Mango tre.Kvantifisering av denaturing geler var mer lineær som tyder på at tilstedeværelsen av Urea i denaturing gel kan gi en mer homogen måte å brette aptamers når de er plassert i TO1 biotin farging løsning. Mango merket RNAs kan oppdages i nærvær av total RNA ved hjelp av TO1 biotin farging sammenlignet med SG farging. Husk å sørge for at gelfargingsbeholderen er stor nok til å passe gelen, ellers kan gelen brettes på seg selv.RNA-prøvene overføres fra ett sted til et annet. I likhet med denaturing geler, kan denne metoden utføres for en innfødt gel. Kjør gelen i et kaldt rom ved lavere wattstyrke for å opprettholde innfødte forhold.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metode for måling av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Endringer i celler og vev

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metode for Isolering av høyt renset RNA fra frø for bruk i Quantitative Analysis transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Deteksjon og visualisering av DNA-skadeinducerte proteinkomplekser i suspensjoncellekulturer ved bruk av næringslysanalysen

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse av oversettelse innvielsen komplekse formasjon på pattedyr mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rask og kostnadseffektiv RNA-ekstraksjon av rottepanasittvev

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...