Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Авторы благодарят Развана Кожокару и Амира Абдолахзаде за техническую помощь и Лену Долгошеину за коррективную прочтение рукописи. Финансирование этого проекта было предоставлено Канадским советом по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в рамках оперативного гранта P.J.U.

1. Подготовка реагентов
<ol><li>
To1-Biotin постстогиврешение решение (гель окрашивающий раствор)
	<ol>
<li>Сделать 1 L 1 M фосфатного буфера на рН 7,2 на 25 градусов по Цельсию, добавив 342 мл 1 М Na2HPO4 и 158 мл 1 M2PO4. Отрегулируйте рН до 7,2 при 50 мМ, добавив соответствующий фосфа?...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

Существенным преимуществом флуоресцентного тега Mango является то, что один тег может быть использован несколькими способами. Высокая яркость и сродство этих aptamers сделать их полезными не только в визуализации клеток 2, но и для in vitro РНК или RNP очистки4. Таким обра?...

Манго представляет собой РНК пометки система, состоящая из набора из четырех небольших флуоресцентных РНК aptamers, которые связывают плотно (наномолярной связывания) к простым производным тиазол-оранжевый (TO1-Биотин, Рисунок 1A)1,2,3 . При связке флуоресценция этого лиганда увеличивается в 1000-4000 раз в зависимости от конкретного аптамера. Высокая яркость системы манго, которая для Манго III превышает уровень улучшенного зеленого флуоресцентного белка (eGFP), в сочетании с наномолярной связывающей сродством аптамеров РНК Манго, позволяет использовать ее как при визуализации, так и в очищении РНК комплексы2,4.
Рентгеновские структуры МангоI5, II6и III7 были определены с высоким разрешением, и все три аптамеров использовать РНК четырехугольник, чтобы связать TO1-Biotin (Рисунок 1B-D). Компактные ядра всех трех аптамеров изолированы от внешней последовательности РНК с помощью компактных адаптеров. Манго I и II оба используют гибкий GNRA-как петля адаптер для подключения их ядер манго к произвольной РНК дуплекс(Рисунок 1B, C). В отличие от этого, Mango III использует жесткий мотив триплекса, чтобы соединить его ядро с произвольной спиралью РНК(рисунок 1D,фиолетовые остатки), в то время как структура Манго IV в настоящее время не известна. Как лиганд-связывающее ядро каждого из этих aptamers отделен от внешней последовательности РНК этими сугнительными адаптерами, кажется вероятным, что все они могут быть просто включены в различные РНК. Бактериальная 6S регулятивная РНК (Манго I), компоненты дрожжевой spliceosome (Манго I), и человека 5S РНК, U6 РНК, и C / D scaRNA (Манго II и IV) все были успешно помечены таким образом2,8, предполагая, что многие многие биологические РНК могут быть помечены с помощью системы РНК Манго aptamer.
Денатуринг и местные гели обычно используются для изучения РНК. Денатуринг гели часто используются для судить размер РНК или РНК обработки, но, как правило, в случае северной пятно, например, требуют нескольких медленных и последовательных шагов для того, чтобы создать изображение. В то время как другие РНК фторгенных аптамеров, таких как РНК шпинат и брокколи, были успешно использованы для геля изображения9, не фторгенной аптамера системы на сегодняшний день не обладает высокой яркостью и сродством системы манго, что делает его значительный интерес для изучения манго гель-изображения способностей. В этом исследовании мы задавались вопросом, может ли система RNA Mango быть просто расширена до геля, так как возбуждение и длина волн выбросов TO1-Biotin (510 нм и 535 нм, соответственно) подходят для визуализации в канале eGFP, обычном для большинства флуоресцентных гелевосканно-сканирующие приборы.
Пост-гель окрашивания протокол, представленный здесь обеспечивает быстрый способ конкретно обнаружить Манго помечены молекулРНЫ в родной и denaturing полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. Этот метод окрашивания включает в себя замачивания гелей в буфере, содержащем калий и TO1-Biotin. РНК Манго aptamers являются G-четверки основе и калий требуется для стабилизации таких структур. Используя РНК, транскрибированные из минимальных мангокодирующих шаблонов ДНК (см. раздел протокола), мы можем просто обнаружить всего лишь 62,5 фмоль РНК в местных гелей и 125 фмоль РНК в денатурации гелей, используя простой протокол окринирования. В отличие от обычных неспецифических ядерных кислотных пятен (см. ТаблицаМатериалов, упомянутых в SG от hereon), мы можем четко определить Манго помечены РНК, даже если высокие концентрации общего untagged РНК присутствуют в образце.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

Родные и денатурные гели полиакриламидов обычно используются для характеристики подвижности рибонуклеопротеина (РНП) и для измерения размера РНК, соответственно. Как и многие методы гель-изображения использовать неспецифические пятна или дорогие фторроновые зонды, чувствительные, дискриминационные, и экономичный гель-изображений методологии являются весьма желательными. ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОсти ядра RNA Mango являются небольшими (19-22 nt) мотивами последовательности, которые, при закрытии произвольного стебля РНК, могут быть просто и недорого приложены к РНК интереса. Эти теги манго связываются с высокой близостью и специфичностью к тиазол-оранжевому флюорофору лиганду под названием TO1-Biotin, который становится в тысячи раз более флуоресцентным при связывании. Здесь мы показываем, что Манго I, II, III и IV могут быть использованы специально для изображения РНК в гели с высокой чувствительностью. Всего лишь 62,5 моль РНК в родных гелей и 125 моль РНК в денатурирующих гелей может быть обнаружена путем замачивания гелей в буфере изображения, содержащем калий и 20 нМ TO1-Биотина в течение 30 мин. Мы демонстрируем специфику манго-тегами системы путем визуализации манго помечены 6S бактериальной РНК в контексте сложной смеси общей бактериальной РНК.

Короткие Манго помечены РНК были подготовлены, как описано в разделе протокола. Предполагая, что флуоресценция в условиях денатурации будет наиболее трудно наблюдать из-за присутствия мочевины в гелях, мы впервые изучили устойчивость манго аптамеров к мочевину, кото?...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Здесь мы представляем чувствительный, быстрый и дискриминационный пост-гель окрашивая метод изображения РНК помечены РНК Манго aptamers I, II, III, или IV, используя либо родной или денатурирующий полиакриламид гель электрофорез (PAGE) гели. После запуска стандартных гелей PAGE, Манго помечены РНК может быть легко окрашены с TO1-Biotin, а затем проанализированы с помощью широко доступных читателей флуоресценции.

Флуоресцентная визуализация Манго помечены РНК в полиакриламида гели с помощью пост-стоиносидный метод

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Манго помечены гель визуализации методологии продемонстрированы здесь является надежным и, как ожидается, будет в состоянии быть просто продлен с точки зрения чувствительности и специфичности. Это еще больше упростило бы рутинную очистку биологически важных РНК и РНК-комплексов путем простого целесообразности добавления манго-тега в РНК, представляющие интерес. РНК в настоящее время вовлечены во все больше и больше заболеваний для этого поста знакомства метод простой и быстрый способ, чтобы иметь возможность отслеживать и визуализировать РНК.Дополнительная осторожность будет необходимо в передаче гель из одного места в другое, как гели хрупкие и склонны к нарушению. Чтобы подготовить 30 миллилитров денатурации гель, сначала выберите полиакриламид процент с соответствующим бромофенол синий, и ксилен цианол красителей по сравнению с РНК интерес для обеспечения разделения высокой полосы. Затем смешайте решения A, B и C в соответствии с таблицей 1 и добавьте APS и timud.Немедленно вылейте гель раствор в соответствующий гель литья аппарата. Вставьте желаемый конус и оставьте гель полимеразе примерно на 30 минут. Составляют гель танк с помощью 1 XTBE решение и тщательно удалить конус.Аккуратно поднимите гель и смонтировать на гель аппарата и обеспечить с помощью связующих клипов. Используя шприц, аспирировать скважины непосредственно перед загрузкой образца. Подготовь 1X РНК образцов, добавив 2X денатурации гель загрузки решение РНК образцов, представляющих интерес.Используйте термоциклер для нагрева образцов при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Затем загрузите охлажденные образцы на дно каждой хорошо с помощью гель загрузки советы. И хорошо гель при комнатной температуре обеспечения власти эффективно низким, чтобы не взломать стеклянную пластину гель аппарата.Подготовка 1X гель окрашивания решение в соответствии с рукописью в чистом стеклянном контейнере, который достаточно широк, чтобы удобно соответствовать гель. Добавьте достаточное количество раствора для окрашивания геля 1X в контейнер, чтобы гель был полностью покрыт раствором при размещении на орбитальном ротаторе. После того, как гель заканчивается работает, удалить гель из аппарата, отрезать its'wells, и угол геля, с тем чтобы помочь определить ориентацию.Затем осторожно перенесите гель в раствор окрашивания геля 1X. Для выполнения изображения, тщательно decant окрашивания раствора и промыть гель быстро с водой. Наконец, осторожно перенесите гель на лоток, который будет помещен в изображение.Roll стеклянный пипетка над гелем, чтобы удалить захваченных пузырьков и избыточной жидкости. И приступить к принятию гель изображения. Манго aptamers один, два, три, четыре были существенно сопротивляться денатурации примерно до одной концентрации молярной мочевины.20 до 40 минут окрашивания времени было достаточно для максимального геля florescence. Более длительное время не подходит для небольших РНК, используемых в этом исследовании, как они начали распространяться из геля. Флюорометр анализ показал, что манго aptamers один, два и три в присутствии мочевины может раз быстрее, чем aptamer четыре.В отсутствие мочевины, складывание было гораздо быстрее, как ожидалось. Чувствительность метода пост-окрашивания была показана одиночными полосами, соответствующими хорошо сложенным РНК для каждого из вариантов манго в родных и денатурированных гелях с немного меньшей чувствительностью для более поздних. Количественная оценка местных гелей была линейной журнала примерно на один порядок величины с Манго один, два и четыре ведут себя более линейно, чем манго три.Количественная оценка денатурации гелей были более линейными, предполагая, что наличие мочевины в денатурации гель может обеспечить более однородный способ сложить aptamers, как только они помещены в TO1 биотин окрашивания решения. Манго помечены РНК могут быть обнаружены в присутствии общей РНК с помощью TO1 биотин окрашивания по сравнению с SG окрашивания. Не забудьте убедиться, что гель окрашивания контейнер достаточно велик, чтобы соответствовать гель в противном случае гель может сложить на себя.Образцы РНК будут передаваться из одного места в другое. Подобно денатурации гелей, этот метод может быть выполнен для родного геля. Вы запустите гель в холодной комнате при более низкой мощности для поддержания родных условий.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

Метод для измерения РНК<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Изменения в клетках и тканях

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Обнаружение и визуализация ДНК-индуцированных белковых комплексов в суспензионных клеточных культурах с использованием анализа лигирования близости

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting анализ перевода инициации комплекс формирования на Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Мониторинг динамики взаимодействия белок-РНК in vivo при высоком временном разрешении с использованием χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Быстрая и экономически эффективная РНК-экстракция крысиной ткани поджелудочной железы

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...