Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Författarna tackar Razvan Cojocaru och Amir Abdolahzadeh för deras tekniska hjälp och Lena Dolgosheina för korrektur läsning av manuskriptet. Finansiering tillhandahölls för detta projekt av ett kanadensiskt naturvetenskapligt och ingenjörs vetenskapligt forsknings råd (NSERC) drifts bidrag till P.J.U.

1. beredning av reagenserna
<ol><li>
TM-lösning för efterfärgning av biotin (gel färgning lösning)
	<ol>
<li>Gör 1 L 1 M fosfatbuffert vid pH 7,2 vid 25 ° c genom tillsats av 342 mL 1 M na2HPO4 och 158 ml 1 m NaH2Po4. Justera pH till 7,2 vid 50 mM genom att tillsätta lämplig fosfat lösning. Steril-filter med hjälp av ett 0,2 μm filter och förvara lösningen i plasticware vid rums temperatur.</li>
		<li>Förbered 5x gel färgning lösning (utan TM...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

En betydande fördel med mango fluorescerande taggen är att en enda tagg kan användas på flera sätt. Den höga ljus styrka och affinitet av dessa aptamers göra dem användbara inte bara för i cell visualisering2 men också för in vitro-RNA eller RNP rening4. Därför, gel Imaging utökar mångsidigheten hos mango taggen på ett enkelt sätt. Mango gel Imaging känslighet är något mindre än en nordlig blot14 men kan lätt upptäcka 60-120 fm...

Mango är ett RNA märknings system som består av en uppsättning av fyra små fluorescerande RNA aptamers som binder tätt (nanomolar bindning) till enkla derivat av thiazol-orange (1-biotin, figur 1a)1,2,3 . Vid bindning ökas fluorescensen av denna ligand 1 000-till 4 000-faldigt beroende på den specifika aptameren. Den höga ljus styrkan hos mango systemet, som för mango III överstiger den av förstärkt grönt fluorescerande protein (egfp), kombinerat med HDAC vid nanomolära bindande affinitet av RNA mango aptamers, gör det möjligt att användas både i Imaging och rening av RNA komplex2,4.
Röntgen strukturerna av mango I5, II 6, och III7 har fastställts till hög upplösning, och alla tre aptamers utnyttja ett RNA FYRPLEX till bind TM1-biotin (figur 1b-D). De kompakta kärnorna av alla tre aptamers isoleras från den externa RNA-sekvensen via kompakta adaptermotiv. Mango I och II båda använder en flexibel GNRA-like loop adapter för att ansluta sina mango kärnor till en godtycklig RNA duplex (figur 1b, C). Däremot använder mango III en styv Triplex motiv för att ansluta sin kärna till en godtycklig RNA Helix (figur 1d, lila rester), medan strukturen av mango IV är för närvarande inte känd. Eftersom den ligand-bindande kärnan i var och en av dessa aptamers är skild från den externa RNA-sekvensen av dessa spiralformade adaptrar, verkar det troligt att de alla kan helt enkelt införlivas i en mängd olika RNAs. Den bakteriella 6s regulatoriska RNA (mango i), komponenter i jäst spliceosome (mango i), och den mänskliga 5s RNA, U6 RNA, och en C/D scarna (mango II och IV) har alla framgångs rikt märkts på detta sätt2,8, vilket tyder på att många biologiska RNAs kan märkas med hjälp av RNA mango Aptamer systemet.
Denaturering och Native gels används ofta för att studera RNAs. Denaturering geler används ofta för att bedöma RNA-storlek eller RNA-bearbetning, men typiskt, i fallet med en nordlig blot, till exempel, kräver flera långsamma och sekventiella steg för att generera en bild. Medan andra RNA fluorogena aptamers, såsom RNA spenat och broccoli, har använts framgångs rikt för gel Imaging9, ingen fluorgenic Aptamer system hittills besitter hög ljus styrka och affinitet av mango systemet, vilket gör det av stort intresse att undersöka mango ' s gel-Imaging förmågor. I denna studie, undrade vi om RNA mango systemet helt enkelt kan utvidgas till gel Imaging, eftersom excitation och utsläpp våg längder av TM-biotin (510 nm och 535 nm, respektive) är lämpliga för avbildning i eGFP-kanalen som är gemensam för de flesta fluorescerande instrument för gel skanning.
Den post-gel färgning protokoll som presenteras här ger ett snabbt sätt att specifikt upptäcka mango-märkta RNA molekyler i infödda och denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) geler. Denna färgning metod innebär blöt läggning geler i en buffert som innehåller kalium och TM-biotin. RNA mango aptamers är G-fyrplex baserat och kalium krävs för att stabilisera sådana strukturer. Använda RNA transkriberas från minimal mango-kodning DNA-mallar (se protokollet avsnitt), kan vi helt enkelt upptäcka så lite så lite som 62,5 fmol av RNA i infödda geler och 125 fmol av RNA i denaturering geler, med hjälp av en enkel färgning protokoll. I motsats till vanliga ospecifika nukleinsyra fläckar (se tabell över material, hänvisas till SG från Hereon), kan vi tydligt identifiera mango-märkta RNA även när höga koncentrationer av totalt omärkta RNA är närvarande i provet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

Native och denaturering polyakrylamidgeler används rutinmässigt för att karakterisera ribonukleoprotein (RNP) komplex rörlighet och för att mäta RNA-storlek, respektive. Eftersom många gel-Imaging tekniker använder ospecifik fläckar eller dyra fluorophore sonder, känsliga, diskriminerande, och ekonomiska gel-Imaging metoder är mycket önskvärt. RNA mango kärnsekvenser är små (19-22 NT) sekvens motiv som, när de stängs av en godtycklig RNA-stam, kan enkelt och billigt bifogas ett RNA av intresse. Dessa mango Taggar binda med hög affinitet och specificitet till en tiazol-orange fluorophore ligand kallas TM-biotin, som blir tusentals gånger mer fluorescerande på bindning. Här visar vi att mango I, II, III, och IV kan användas för att specifikt bild-RNA i geler med hög känslighet. Så lite som 62,5 fmol av RNA i infödda geler och 125 fmol av RNA i denatureringen geler kan upptäckas genom blöt läggning geler i en avbildning buffert som innehåller kalium och 20 nM-TM-biotin för 30 min. Vi demonstrerar särdragen hos mango-märkta systemet genom att avbilda en mango-Tagged 6S bakterie-RNA i samband med en komplex blandning av totalt bakteriellt RNA.

Kort mango-märkta RNAs har förberetts enligt beskrivningen i protokoll sektionen. Om man antar att fluorescens i denaturering villkor skulle vara svårast att observera på grund av närvaron av urea i gelerna, vi först studerade motståndet av mango aptamers till urea, som fungerar som en nukleinsyra denaturerande. Vi fann att mango aptamers är väsentligen resistenta mot denaturering upp till en urea koncentration på cirka 1 M (figur 2A). Innan du lägger till gel ...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Här presenterar vi en känslig, snabb och diskriminerande post-gel färgning metod för att bilden RNAs märkta med RNA mango aptamers I, II, III, eller IV, med antingen infödda eller denaturering polyakrylamid gel elektrofores (PAGE) geler. Efter att ha kört standard PAGE gels, kan mango-taggade RNA lätt färgas med TM-biotin och sedan analyseras med vanligt förekommande fluorescensläsare.

Fluorescerande visualisering av mango-Tagged RNA i polyakrylamidgeler via en Efterfärgnings metod

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Den Mango-taggade gelavbildningsmetodiken som demonstreras här är robust och förväntas helt enkelt kunna förlängas när det gäller känslighet och specificitet. Detta skulle ytterligare förenkla den rutinmässiga reningen av biologiskt viktiga RNA och RNA-komplex genom att det enkla ändamålsenligt att lägga till en Mango-tagg till RNA av intresse. RNAs är inblandad i fler och fler sjukdomar härför detta inlägg dating metod är ett enkelt och snabbt sätt att kunna spåra och visualisera RNA.Extra omsorg kommer att krävas för att överföra gelen från en plats till en annan eftersom gelerna är ömtåliga och benägna att bryta. För att förbereda en 30 milliliter denaturering gel, välj först den polyakrylamide procent med lämplig Bromophenol blå, och xylen cyanol färgämnen jämfört med ett RNA av intresse för att försäkra hög band separation. Blanda sedan lösningar A, B och C enligt tabell ett och lägg till APS och timud.Häll omedelbart gellösningen i en lämplig gelgjutningsapparat. Sätt i önskad kon och låt gelen vara till polymeras i cirka 30 minuter. Gör upp gelbehållaren med hjälp av 1 XTBE-lösning och ta försiktigt bort konen.Lyft försiktigt upp gelén och montera på gelapparaten och säkra med hjälp av bindemedelsclips. Med hjälp av en spruta, aspirera ut brunnarna omedelbart före provbelastningen. Förbered 1X RNA-prover genom att tillsätta 2X denaturering av gelladdningslösning till RNA-proverna av intresse.Använd en termocyklare för att värma proverna vid 95 grader Celsius i fem minuter. Sedan, ladda kylda prover till botten av varje brunn med hjälp av gel lastning tips. Och väl gelen vid rumstemperatur se till att kraften är effektivt låg för att inte knäcka glasskivan av gelapparaten.Förbered 1X gelfärgningslösning enligt manuskriptet i en ren glasbehållare som är tillräckligt bred för att bekvämt passa gelen. Tillsätt tillräckligt med 1X gelfärgningslösning till behållaren så att gelen är helt täckt med lösningen när den placeras på en orbitalrotator. När gelen är klar kör, ta bort gelen från apparaten, skär av its'wells, och ett hörn av gelen för att hjälpa till att bestämma orienteringen.Överför sedan försiktigt gelen till 1X gelfärgningslösningen. För att utföra avbildningen, dekantera försiktigt färgningslösningen och skölj gelen snabbt med vatten. Slutligen, försiktigt överföra gelen på facket som ska placeras i imager.Rulla en glaspipett över gelen för att avlägsna fångade bubblor och överflödig vätska. Och fortsätt att ta en gel bild. Mango aptamers en, två, tre, fyra var väsentligen motstå till denaturation upp till ungefärligt en molar Urea koncentration.20 till 40 minuters färgningstid var tillräcklig för maximal gel florescence. Längre tid var inte lämplig för små RNA som används i denna studie som de började sprida ut ur gelen. Fluorometer analys visade att Mango aptamers en, två och tre i närvaro av Urea kunde vika snabbare än aptamer fyra.I avsaknad av Urea var vikning mycket snabbare som förväntades. Känsligheten för post färgning metoden visades av enstaka band som motsvarar väl vikta RNAs för var och en av Mango varianterna i infödda och denaturering geler med en något mindre känslighet för den senare. Kvantifiering av inhemska geler var log linjär över ungefär en storleksordning med Mango en, två, och fyra beter sig på ett mer linjärt sätt än Mango tre.Kvantifiering av denatureringsgeler var mer linjära vilket tyder på att förekomsten av Urea i denatureringsgelen kan ge ett mer homogent sätt att vika aptamererna när de placeras i TO1-biotinfärgningslösningen. Mango taggade RNAs kan detekteras i närvaro av totala RNA med hjälp av TO1 biotin färgning jämfört med SG färgning. Kom ihåg att se till att gelfärgningsbehållaren är tillräckligt stor för att få plats med gelén annars kan gelen vikas på sig själv.RNA-proverna kommer att överföras från en plats till en annan. I likhet med denatureringsgelerna kan denna metod utföras för en infödd gel. Kör gelen i ett kylrum vid en lägre wattal för att upprätthålla inhemska förhållanden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

En metod för mätning av RNA<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -methyladenosine Ändringar i celler och vävnader

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

En effektiv metod för isolering av högrenat RNA från frön för användning i kvantitativ transkriptom analys

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Detektion och visualisering av DNA-skada-inducerad proteinkomplex i suspensionscellkulturer med användning av Proximity Ligation Assay

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analys av översättning inledande komplexa bildande på däggdjur mRNA

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Snabb och kostnadseffektiv RNA-utvinning av råtta bukspottskörteln vävnad

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...