Name: fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method
Uploaded: 2019-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Yazarlar, teknik yardım ve Lena dolgosheina için el yazması redaksiyon için Razvan Cojocaru ve Amir ağahzadeh teşekkür ederiz. Bu proje için bir Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) P.J.U. için işletme hibe tarafından finansman sağlandı

1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>
TO1-biotin sonrası boyama çözeltisi (jel boyama çözeltisi)
	<ol>
<li>1 m2HPO4 ve 158 ml 1 m Nah2Po4' ü 342 ml ekleyerek, 25 °C ' de pH 7,2 ' de 1 m fosfat tampon yapın. Uygun fosfat çözeltisi ekleyerek pH 'ı 50 mM 'ye 7,2 olarak ayarlayın. 0,2 μm filtre kullanılarak steril filtre ve solüsyonu oda sıcaklığında plastikte saklayın.</li>
		<li>5x jel boyama çözeltisi (TO1-biotin olmadan) aşağıdaki g...

<ol>
	<li>Dolgosheina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Mango+Aptamer-Fluorophore:+A+Bright,+High-Affinity+Complex+for+RNA+Labeling+and+Tracking.">RNA Mango Aptamer-Fluorophore: A Bright, High-Affinity Complex for RNA Labeling and Tracking.</a> ACS Chemical Biology. , (2014).</li><li>Autour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorogenic+RNA+Mango+aptamers+for+imaging+small+non-coding+RNAs+in+mammalian+cells.">Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells.</a> Nature Communications. 9, 656 (2018).</li><li>Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorophore-binding+RNA+aptamers+and+their+applications:+Fluorophore-binding+RNA+aptamers.">Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).</li><li>Panchapakesan, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleoprotein+Purification+and+Characterization+using+RNA+Mango.">Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango.</a> RNA. , 1592-1599 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+high-affinity+fluorophore+binding+and+activation+by+RNA+Mango.">Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango.</a> Nature Chemical Biology. 13, 807 (2017).</li><li>Trachman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+the+Mango-II+RNA+Aptamer+Reveal+Heterogeneous+Fluorophore+Binding+and+Guide+Engineering+of+Variants+with+Improved+Selectivity+and+Brightness.">Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness.</a> Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).</li><li>Trachman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mango-III+is+a+compact+fluorogenic+RNA+aptamer+of+unusual+structural+complexity.">Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity.</a> Nature Chemical Biology. , (2018).</li><li>Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+complex+purification+using+high-affinity+fluorescent+RNA+aptamer+tags.">RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).</li><li>Filonov, G. S., Kam, C. W., Song, W., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+imaging+of+RNA+processing+using+Broccoli+reveals+optimal+aptamer+expression+strategies.">In-gel imaging of RNA processing using Broccoli reveals optimal aptamer expression strategies.</a> Chemistry &amp; Biology. 22, 649-660 (2015).</li><li>Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligoribonucleotide+synthesis+using+T7+RNA+polymerase+and+synthetic+DNA+templates.">Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates.</a> Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).</li><li>A Typical DNase I Reaction Protocol (M0303). NEB Available from: <a target="_blank" href="https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303">https://www.neb.com/protocols/1/01/01/a-typical-dnase-i-reaction-protocol-m0303</a> (2018)</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Nucleic+Acids+by+Extraction+with+Phenol:Chloroform.">Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li><li>Tuma, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+SYBR+Gold+Nucleic+Acid+Gel+Stain:+A+Dye+Optimized+for+Use+with+300-nm+Ultraviolet+Transilluminators.">Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators.</a> Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).</li><li>Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis+for+detection+and+quantification+of+RNA+in+pancreatic+cancer+cells+and+tissues.">Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues.</a> Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).</li><li>Ebhardt, H. A., Unrau, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+multiple+exogenous+and+endogenous+small+RNA+populations+in+parallel+with+subfemtomolar+sensitivity+using+a+streptavidin+gel-shift+assay.">Characterizing multiple exogenous and endogenous small RNA populations in parallel with subfemtomolar sensitivity using a streptavidin gel-shift assay.</a> RNA. 15, 724-731 (2009).</li></ol>

Mango floresan etiketinin önemli bir avantajı, tek bir etiketin birden çok şekilde kullanılabilmesi. Bu aptamers yüksek parlaklık ve yakınlık onları sadece hücre görselleştirme2 için değil, aynı zamanda In vitro RNA veya RNP arıtma4için yararlı hale. Bu nedenle jel görüntüleme, Mango etiketinin çok yönlülüğünü basit bir şekilde genişletir. Mango jel görüntüleme hassasiyeti, Kuzey leke14 ' ten biraz daha azdır, ancak...

Mango (TO1-biotin, Şekil 1a) thiazole-turuncu basit türevleri için sıkıca (nanomolar bağlayıcı) bind dört küçük floresan RNA aptamers bir dizi oluşan bir RNA etiketleme sistemi,1,2,3 . Bağlayıcı üzerine, bu ligin floresans 1.000 artar-4.000-belirli aptamer bağlı olarak katlayın. Mango III, RNA Mango aptamers nanomolar bağlayıcı benzeşme ile birlikte geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP), aşan Mango sisteminin yüksek parlaklık, görüntüleme ve RNA arıtma hem de kullanılmasını sağlar kompleksleri2,4.
Mango ı5, II6ve III7 ' nin X-ışını yapıları yüksek çözünürlükte tespit edilmiştir ve üç aptamer, BIND to1-biotin (Şekil 1B-D) için RNA dörtlü kullanır. Tüm üç aptamerlerin kompakt çekirdeği, kompakt adaptör motifleri ile harici RNA dizisinden yalıtılır. Mango ı ve II her ikisi de kendi Mango çekirdeğini keyfi RNA Dubleks (Şekil 1B, C) ile bağlamak için esnek bir GNRA benzeri döngü adaptörünü kullanmaktadır. Bunun aksine, Mango III, çekirdeğini rasgele bir RNA heline (Şekil 1D, mor kalıntıları) bağlamak için sert bir Tripleks motif kullanır ve Mango IV 'ün yapısı şu anda bilinmemektedir. Bu aptamerlerin her birinin ligand-bağlayıcı çekirdeği, bu helisel adaptörler tarafından harici RNA dizisinden ayrıldığı için, bunların hepsi sadece çeşitli RNAs 'larla birleştirilebilir. Bakteriyel 6s düzenleyici RNA (Mango ı), Maya spliceosome bileşenleri (Mango ı), ve insan 5s RNA, U6 RNA, ve C/D scarna (Mango II ve IV) tüm başarıyla bu moda etiketlenmiş oldu2,8, düşündüren birçok biyolojik RNAs RNA Mango aptamer sistemi kullanılarak etiketlenebilir.
Denaturing ve yerel jelleri genellikle RNAs okumak için kullanılır. Denaturing jeller genellikle RNA boyutu veya RNA işleme yargılamak için kullanılır, ancak genellikle, bir Kuzey Blot durumunda, örneğin, bir görüntü oluşturmak için birkaç yavaş ve sıralı adımlar gerektirir. RNA ıspanak ve brokoli gibi diğer RNA fluorojenik aptamers, jel görüntüleme9için başarıyla kullanılırken, bugüne kadar hiçbir flororojenik aptamer sistemi, Mango sisteminin yüksek parlaklığını ve benzeşimine sahiptir, bu da önemli bir ilgi Mango jel görüntüleme yeteneklerini araştırmak için. Bu çalışmada, RNA Mango sisteminin sadece jel görüntülemede uzatılabilir olup olmadığını merak ettik, TO1-biotin (510 nm ve 535 Nm) uyarma ve emisyon dalga boyları (sırasıyla), en floresan için ortak olan eGFP kanalında görüntüleme için uygundur. jel tarama enstrümantasyonu.
Burada sunulan jel boyama protokolü, yerel ve denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri içinde özellikle Mango etiketli RNA moleküllerini algılamak için hızlı bir yol sağlar. Bu boyama yöntemi, potasyum ve TO1-biotin içeren bir tampon içinde jelleri içerir. RNA Mango aptamerleri bu tür yapıları stabilize etmek için G-quadruplex bazlı ve potasyum gereklidir. RNA 'nın minimal Mango-kodlama DNA şablonlarından transkripsiyonu kullanarak (protokol bölümüne bakın), basit bir boyama protokolü kullanarak, yerel jellerin RNA 'sında 62,5 fmol ve denatüre jeller arasında 125 fmol olarak az az tespit edebilirsiniz. Ortak nonspesifik nükleik asit lekeleri aksine (bkz: malzeme tablosu, hereon gelen SG atıfta), biz açıkça tanımlayabiliriz Mango-etiketlenmiş RNA yüksek konsantrasyonlarda toplam etiketsiz RNA örneklerde mevcut olduğunda bile.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:924px;" width="924">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">0.8mm Thick Comb 14 Wells for 30 mL PAGE gels</td>
			<td style="width:192px;">LabRepCo</td>
			<td style="width:147px;">11956042</td>
			<td style="width:275px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">101-1000 &#181;L&#160; tips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>02-707-511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20-200 &#181;L low retention&#160; tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-717-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 19:1)</td>
			<td>Bioreagents</td>
			<td>BP1406-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrylamide:N,N&#39;-methylenebisacrylamide (40% 29:1)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1408-1</td>
			<td>Acute toxicity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>02116-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium backed TLC plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>1164840001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham Imager 600</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29083461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Persulfate</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>Harmful</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BL21 cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C2527H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Boric Acid</td>
			<td>ACP</td>
			<td>B-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol Blue sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B8026-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloloform</td>
			<td>ACP</td>
			<td>C3300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma Aldrich Alcohols</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase I</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>EN0525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA Disodium Salt</td>
			<td>ACP</td>
			<td>E-4320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Commerial&#160;</td>
			<td>P016EAAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide 99%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gel apparatus set with spacers and combs</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>41077017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Dish with Plastic lid</td>
			<td>Pyrex</td>
			<td>1122963</td>
			<td style="width:275px;">Should be large enough to fit your gel piece</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>43567-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Anachemia</td>
			<td>464140468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageQuanTL</td>
			<td>GE Healthcare Lifesciences</td>
			<td>29000605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IPTG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15529-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>P-2940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgCl2</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>4903-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>ACP</td>
			<td>S-2830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaOH</td>
			<td>BDH</td>
			<td>BDH9292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Orbital Rotator</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15513-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Round Gel Loading tips</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CS004853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic</td>
			<td>Caledron</td>
			<td>8180-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBRGold</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 RNA Polymerase</td>
			<td>ABM</td>
			<td>E041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TEMED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7024-50 ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TO1-3PEG-Biotin Fluorophore</td>
			<td>ABM</td>
			<td>G955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Base</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP152-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tryptone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1421-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9496-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Urea</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>U15-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene Cyanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X4126-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>YEX401.500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescent visualization of mango-tagged rna in polyacrylamide gels via a poststaining method

Doğal ve denatüre Poliakrilamid jelleri, ribonukleoprotein (RNP) karmaşık mobilitesini karakterize etmek ve sırasıyla RNA boyutunu ölçmek için rutin olarak kullanılır. Birçok jel görüntüleme tekniği, spesifik olmayan lekeler veya pahalı fluorophore probları, hassas, ayrımcılık ve ekonomik jel görüntüleme metodolojileri çok tercih edilir. RNA Mango çekirdek dizileri, rasgele bir RNA kökü ile kapalıyken sadece ve pahalı olmayan bir RNA 'ya eklenebilen küçük (19 – 22 NT) sıralı motifler. Bu mango Etiketler bağlama üzerine binlerce kez daha floresan olur TO1-biotin denilen bir thiazole-turuncu fluorophore ligand için yüksek yakınlık ve özgüllük ile bağlayın. Burada Mango ı, II, III ve IV, yüksek hassasiyetle jeller RNA özellikle görüntü için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. Doğal jellerin RNA 'nın 62,5 fmol 'sı ve 125 fmol olarak da denatüre jeller,% 30 dakika boyunca potasyum ve 20 Nm to1-biotin içeren bir görüntüleme tamponunun içinde jel ile tespit edilebilir. Mango etiketli sistemin özgüllüğünü, toplam bakteriyel RNA 'nın karmaşık bir karışımı bağlamında Mango etiketli 6S bakteriyel RNA 'nın görüntülemesi ile gösteriyoruz.

Kısa Mango-Tagged RNAs protokol bölümünde açıklandığı gibi hazırlanmıştır. Denatüre koşullarda floresan, jellerin üre varlığı nedeniyle gözlemlemek en zor olacağını varsayarsak, ilk olarak bir nüklik asit denaturant olarak davranan üre, Mango aptamers direnci okudu. Biz mango aptamers yaklaşık 1 M üre konsantrasyonuna kadar denatürasyon önemli ölçüde dirençli olduğunu bulundu (Şekil 2a). Bir denatüre jel jel boyama solüsyonu eklemeden...

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method at JoVE.com

Fluorescent Visualization of Mango-tagged RNA in Polyacrylamide Gels via a Poststaining Method

Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas 'ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.

Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Native and denaturing polyacrylamide gels are routinely used to characterize ribonucleoprotein (RNP) complex mobility and to measure RNA size, ...

Burada gösterilen Mango etiketli jel görüntüleme metodolojisi sağlamdır ve duyarlılık ve özgüllük açısından sadece uzatılabilmeleri beklenmektedir. Bu daha da ilgi RNA bir Mango etiketi ekleyerek basit bir expedient tarafından biyolojik olarak önemli RNA ve RNA komplekslerinin rutin arıtma basitleştirmek olacaktır. RNA'lar bu yazı tarihleme yöntemi için daha fazla hastalığa bulaşmak için rna izlemek ve görselleştirmek için kolay ve hızlı bir yoldur.Jeller kırılgan ve kırılmayatkın olduğu için jelin bir yerden başka bir yere aktarılmasında ekstra özen gerekir. 30 mililitreden kalma denaturing jel hazırlamak için, öncelikle uygun Bromofenol mavisi ile poliakrilamid yüzdesini seçin ve yüksek bant ayrılığını sigortalamak için bir RNA ile karşılaştırıldığında ksilen cyanol boyaları. Daha sonra, tablo bir göre A, B ve C çözeltileri karıştırın ve APS ve timud ekleyin.Hemen uygun bir jel döküm aparatı içine jel çözeltisi dökün. İstediğini koni ekleyin ve yaklaşık 30 dakika polimeraz jel bırakın. Jel tankı 1 XTBE çözeltisi kullanarak yapın ve koniyi dikkatlice çıkarın.Jeli dikkatlice kaldırın ve jel aparatıüzerine monte edin ve bağlayıcı klipsleri kullanarak güvenli. Bir şırınga kullanarak, numune yüklemeden hemen önce kuyuları aspire edin. RNA'nın ilgi çekici örneklerine 2X denatüre jel yükleme çözeltisi ekleyerek 1X RNA numuneleri hazırlayın.Örnekleri 95 derecede beş dakika ısıtmak için bir termocycler kullanın. Daha sonra, jel yükleme ipuçlarını kullanarak her kuyunun dibine soğutulmuş numuneleri yükleyin. Ve iyi oda sıcaklığında jel güç etkili jel aparatının cam plaka çatlamak için düşük olmasını sağlamak.Jele rahatça sığacak kadar geniş bir cam kapta el yazmasına göre 1X jel boyama solüsyonu hazırlayın. Jel orbital bir rotator üzerine yerleştirilir tamamen çözelti ile kaplı böylece konteyner için yeterli 1X jel boyama çözeltisi ekleyin. Jel çalışma bittikten sonra, aparattan jeli çıkarın, onun'wells kesip, ve yönünü belirlemeye yardımcı olmak için jel bir köşe.Daha sonra jeli dikkatlice 1X jel boyama solüsyonuna aktarın. Görüntülemeyi gerçekleştirmek için, boyama çözeltisini dikkatlice decantın ve jeli suyla hızlıca durulayın. Son olarak, dikkatle görüntüleyici yerleştirilecek tepsiye jel aktarın.Sıkışmış kabarcıklar ve aşırı sıvı kaldırmak için jel üzerinde bir cam pipet rulo. Ve bir jel görüntü alarak devam edin. Mango aptamers bir, iki, üç, dört önemli ölçüde yaklaşık bir azı üre konsantrasyonu kadar denatürasyon karşı idi.Maksimum jel floresansı için 20-40 dakikalık boyama süresi yeterliydi. Daha uzun süre jel dışarı diffüz başladı gibi bu çalışmada kullanılan küçük RNA'lar için uygun değildi. Florometre analizi, Mango aptamers bir, iki ve üç Üre varlığında daha hızlı aptamer dört daha hızlı kat olabilir gösterdi.Üre yokluğunda, katlama beklendiği gibi çok daha hızlı oldu. Post boyama yönteminin hassasiyeti, yerli ve denaturing jellerde mango varyantlarının her biri için iyi katlanmış RNA'lara karşılık gelen tek bantlar tarafından gösterilmiştir. Yerli jellerin sayısallaştırılması Mango bir, iki ve dört Mango üç daha doğrusal bir şekilde davranan büyüklüğü yaklaşık bir sıra üzerinde doğrusal bir günlük oldu.Denaturing jellerin sayısallaştırılması, denaturing jelde Üre varlığının TO1 biotin boyama solüsyonuna yerleştirildikten sonra aptamerleri katlamak için daha homojen bir yol olabileceğini düşündüren daha doğrusal dı. Mango etiketli RNA'lar, SG boyamaya göre TO1 biotin boyama kullanılarak total RNA varlığında saptanabilir. Jel boyama kabı jel uyacak kadar büyük olduğundan emin olmak için unutmayın aksi takdirde jel kendisi üzerine katlanabilir.RNA örnekleri bir yerden diğerine aktarılacaktır. Denaturing jeller benzer, bu yöntem yerli jel için yapılabilir. Doğal koşulları korumak için daha düşük bir watt soğuk bir odada jel çalıştırın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Detection and Visualization of DNA Damage-induced Protein Complexes in Suspension Cell Cultures Using the Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Testi ile Süspansiyon Hücre Kültürlerinde DNA Hasarına Bağlı Protein Komplekslerinin Saptanması ve Görselleştirilmesi

The DNA damage response orchestrates the repair of DNA lesions that occur spontaneously, are caused by genotoxic stress, or appear in the context of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Demir içeriği tesislerinde ölçme kolorimetrik yöntemi

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Rat Pankreas Dokusunun Hızlı ve Uygun Maliyetli RNA Ekstraksiyonu

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...