Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (R01DE020843 bis Y.M.), der International FOP Association (Y.M.) und einem Stipendium der National Natural Science Foundation of China (31500788 bis J.Y.) unterstützt.

Alle Mausexperimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Michigan durchgeführt, die die humane Pflege und den Einsatz von Tieren in der Forschung betreffen. Alle in dieser Studie verwendeten tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Michigan (Protokoll #PRO00007715) genehmigt.
1. Gewebevorbereitung
<ol><li>
Herstellung von embryonalen Geweben
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 10 cm Schale und...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung von Mauskopf und nicht verkalkten Knochengeweben und Kryosektionen zur Immunfärbung der Zellproliferation, des Zelltodes und der BMP-Signalmarker. Wir beschreiben auch die Strategie zur Gewinnung quantitativer Daten aus immunfluoreszierenden Bildern. Diese Methoden können auch auf andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen anwendbar sein.
Die Bedingungen für die Gewebevorbereitung variieren je nach Größe und Art des Ge...

Das Gesicht ist ein wichtiger Teil der menschlichen Identität, und besteht aus verschiedenen Arten von Geweben, wie Epithel, Muskel, Knochen, Knorpel, Zahn. Diese Gewebe werden aus allen drei Keimschichten abgeleitet: Ektoderm, Endoderm und Mesoderm1,2. Für die richtige Musterung und Entwicklung von craniofacial Geweben, Zellproliferation, Tod und Differenzierung müssen stark koordiniert und reguliert werden durch spezifische Signalwege, wie Wnt, Fgf, Hh und Bmp Wege3,4 ,5. Defekte in der Proliferation, Überleben oder Differenzierung von Zellen führen zu craniofacial Fehlbildungen, die zu den am häufigsten auftretenden angeborenen Geburtsfehlern gehören. Transgene Mäuse sind nützliche Werkzeuge, um Mechanismen der craniofacial Morphogenese und Pathogenese1,2,3,4,5zu untersuchen. Das Verständnis der Veränderungen der craniofacial Strukturen während der Entwicklung und Pathogenese wird dazu beitragen, die wichtigsten Entwicklungsprinzipien sowie die Mechanismen der craniofacial Mformationen1,2,3 zu klären ,4,5.
Die Färbung ganzer Reit- oder Schnittgewebe mit spezifischen Antikörpern ist eine unschätzbare Technik zur Bestimmung der räumlichen Verteilung von Proteinen von Interesse 6. Formal kann sich die Gewebeimmunfärbung entweder auf die Immunhistochemie (IHC) oder die Immunfluoreszenz (IF) stützen. Im Vergleich zu dem opaken Reaktionsprodukt, das mit einem chromogenen Substrat wie 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) von IHC erzeugt wird, beinhaltet IF die Verwendung von fluoreszierenden Konjugaten, die durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar sind. Daher kann IF positive Zellen deutlich von Hintergrundrauschen unterscheiden und ermöglicht es, Bilder auf einfache Weise durch Software wie ImageJ und Adobe Photoshop7,8zu analysieren und zu verbessern. Der gesamte Mount-Färbungsansatz funktioniert auf kleinen Gewebeblöcken (weniger als 5 mm dick), die dreidimensionale Informationen über die Lage von Proteinen/Antigenen liefern können, ohne dass eine Rekonstruktion aus den Abschnitten9,10 erforderlich ist. . Im Vergleich zu Gewebeabschnitten ist die Immunfärbung ganzer Halterungen jedoch zeitaufwändig und erfordert große Mengen an Antikörperlösungen. Nicht alle Antikörper sind mit dem grundlegenden Gesamtmontageansatz kompatibel. Darüber hinaus führt das unvollständige Eindringen von Antikörpern zu ungleichmäßigen Färbungen oder falsch negativen Färbungen. Hier konzentrieren wir uns auf den Immunfluoreszenznachweis von Proteinen/Antigenen auf geschnittenen Geweben. Bei hartem Gewebe (z.B. Kopf, Zahn, langer Knochen) erschwert die Kalziumablagerung während der Entwicklung/Pathogenese die Entnahme der Probe und wird während der Immunfärbung semmen1,12leicht abspült. Die meisten der derzeit verfügbaren Protokolle entkalken harte Gewebe vor der Einbettung, um das Teilen zu erleichtern, was zeitaufwändig ist und Morphologie und Antigene von Proben zerstören kann, wenn sie unsachgemäß behandelt werden11,12. Um die Probleme zu überwinden, optimierten wir einen Ansatz für das Kryosektionen von hartem Gewebe ohne Entkalkung, was zu einer verbesserten Visualisierung ihrer Morphologie und Verteilung von Signalproteinen führte.
Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um morphometrische und histologische Veränderungen im craniofaziale Gewebe von Transgenen Von BMP-Mäusen zu bestimmen. Konkret umfasst das Protokoll (1) Ernte und Sezieren von Kopfgeweben, (2) Abschnitt und Immunostainierung von experimentellen Markern (Ki67, pSmad1/5/9) zusammen mit TUNEL-Färbung, (3) Abbildung der Abschnitte mit Fluoreszenzmikroskop und schließlich (4) Analyse und Quantifizierung der Ergebnisse. Das Protokoll zur Vorbereitung und Kryosektion von hartem Gewebe ohne Entkalkung wird ebenfalls beschrieben13. Diese Methoden sind für craniofacial Gewebe optimiert. Sie gelten auch für andere Gewebe aus verschiedenen Altersgruppen von Proben mit entsprechenden Modifikationen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

Die Gewebeimmunostainierung ermöglicht einen hochspezifischen und zuverlässigen Nachweis von Proteinen, die innerhalb eines bestimmten Gewebes von Interesse sind. Hier beschreiben wir ein vollständiges und einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinexpression während der craniofacialmorphogenese/pathogenese anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele. Das Protokoll besteht aus der Aufbereitung und Kryosektion von Geweben, indirekter Immunfluoreszenz, Bildaufnahme und Quantifizierung. Darüber hinaus wird eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben zur Immunfärbung beschrieben, bei der craniofacial Gewebe und lange Knochen als Beispiele verwendet werden. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Bestimmung der Proteinexpression und morphologischen/anatomischen Veränderungen in verschiedenen Geweben während der kraniofazianischen Morphogenese/Pathogenese. Sie gelten auch für andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen. Kenntnisse der Histologie und eine hohe Qualität der Abschnitte sind entscheidend, um wissenschaftliche Schlussfolgerungen aus experimentellen Ergebnissen zu ziehen. Mögliche Einschränkungen dieser Methodik sind unter anderem die Spezifität von Antikörpern und Quantifizierungsschwierigkeiten, die auch hier erörtert werden.

Embryonale craniofacial Gewebeabschnitte Nach den obigen Schritten wurden die Köpfe am embryonalen Tag (E) 16,5 oder 18,5 von der Kontrolle (P0-Cre) oder mutierten (konstitutiv aktivierten Bmpr1a in neuralen Kammzellen, P0-Cre; caBmpr1a) Embryonen seziert. Nach der Fixierung in 4% PFA für 4 h wurden die Proben in OCT eingebettet und koronal kryosectioniert. Die ergebnisseweise Abschnitte wurden mit Antikörpern gegen pSmad1/5/9 (nachgeschaltete BMP-...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung des Proteinspiegels während der craniofacialmorphogenese/pathogenese durch Immunfärbung anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben von jungen Mäusen zur Immunfärbung.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Hier stellen wir Ihnen unser einfaches Protokoll zum Immunfluoreszenznachweis auf Proteinen auf schnittten Materialien vor. Diese Methode erfordert keinen Antigenabruf. Wir verwenden Mausköpfe, einschließlich nicht verkalkter harter Gewebe.Der Hauptvorteil dieser Technik ist es, Antigen-Retrieval und Entkalkung von hartem Gewebe zu überspringen. Diese führen zu einer guten Qualität der immunstainierenden Ergebnisse. Diese Methode spart auch Zeit und Arbeit.Diese Methode ist auch auf andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen anwendbar. Um schöne Abschnitte aus nicht verkalkten Geweben zu machen, sezieren Sie Ihr Zielgewebe weiter, um umgebende Gewebe zu trimmen, und behandeln Sie bei Bedarf die Proben mit 10% EDTA bei vier Grad Celsius für zwei Tage vor dem Kryoschutz. Die visuelle Demonstration bietet eine detaillierte und klare Erläuterung des Verfahrens dieser Methode.Zu Beginn bereiten Sie für jede trächtige Maus ein 10-Zentimeter- und mehrere 3,5-Zentimeter-Geschirr mit PBS und eine 12-Well-Kulturplatte mit zwei Millilitern 4%PFA in PBS in jedem Brunnen zu und legen sie alle auf Eis. Um Embryonen von schwangeren Mäusen zu sezieren, greifen Sie die Haut unter der Mitte des Bauches einer eingeschläferten Maus mit Zange, schneiden Sie nur durch die Haut und ziehen Sie sie dann sanft an der Haut, um sie von der darunter liegenden Bauchmuskelwand zu trennen. Nach der gleichen Linie des Hautschnitts, in die Bauchhöhle geschnitten.Entfernen Sie die Gebärmutter, die eine Reihe von Embryonen enthält. Entfernen Sie dann die Embryonen, indem Sie die Gebärmutterwand vorsichtig abschneiden, wodurch die extraembryonalen Gewebe wie der Dottersack und das Amnion entfernt werden. Schneiden und isolieren Sie den Kopf von jedem Embryo, und mit Zangen übertragen Jeden Kopf in einen separaten Brunnen einer 12-Well-Platte mit 4%PFA.Inkubieren Bei vier Grad Celsius für vier Stunden zu beheben. Spülen Sie die Köpfe in PBS bei vier Grad Celsius mit sanftem Schütteln für 12 Stunden. Um die Köpfe kryoprotectzuschützen, übertragen Sie sie mit Zangen in eine neue 12-Well-Platte, die zwei Milliliter 30%Saccharose in PBS enthält.Mit sanfter Rührung bei vier Grad Celsius bebrüten, bis die Köpfe auf den Boden der Schale sinken. Um die kryogeschützten Köpfe einzubetten, übertragen Sie sie in eine Form mit optimaler Schnitttemperaturverbindung und gleichnden Sie für einige Minuten. Passen Sie mit Zangen die Position und Richtung der Proben so an, dass die getrimmte Seite der Proben mit der Unterseite der Einbettform zu sehen ist.Dann legen Sie die Form auf Trockeneis zu gefrieren, und lagern Sie in einer Plastiktüte bei minus 80 Grad Celsius, bis bereit für Kryosektionen. Für postnatales Gewebe, nach dem Entfernen der Haut und Fettgewebe einer eingeschläferten, drei Wochen bis drei Monate alten Maus, schneiden und isolieren Sie den Kopf und entfernen Sie den Unterkiefer. Dann fixieren und kryoprotect den Kopf wie mit Embryoköpfen getan.In 8% Gelatine in ähnlicher Weise einbetten wie Embryoköpfe in OCT, und halten Sie die Cryomolds in einer Plastiktüte bei minus 80 Grad Celsius bis zum Kryosektionen. Stellen Sie die entsprechende Kryostattemperatur ein. Legen Sie die Proben für etwa 30 Minuten in die Kryostatkammer, um die Kryostattemperatur zu ausgrenzen.Entfernen Sie den Block mit der Probe aus dem Cryomold, und montieren Sie ihn mit einem OCT-Tropfen auf das Probenfutter und frieren Sie ihn ein, um sicherzustellen, dass die getrimmte Seite der Probe am weitesten vom Futter entfernt bleibt und dem Bediener zugewandt ist. Laden Sie das blockmontierte Futter auf den Cryostat-Objekthalter. Stellen Sie den Klingenhalter so ein, dass der Klingenwinkel drei bis fünf Grad relativ zur Probe beträgt.Sammeln Sie 10-Mikrometer-Abschnitte auf beschichteten Mikroskop-Dias. Lassen Sie die Abschnitte bei Raumtemperatur bis vollständig trocken, und speichern Sie sie dann bei minus 80 Grad Celsius. Um mit der Färbung zu beginnen, nehmen Sie Rutschen von minus 80 Grad Celsius heraus und halten Sie sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur, um die Abschnitte lufttrocken zu halten.Spülen Sie die Dias in 0,1%PBST dreimal für jeweils fünf Minuten, um OCT auszuwaschen und die Abschnitte zu durchdringen. Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierlösung zu jeder Folie hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Entfernen Sie dann die Blockierlösung, ohne die Folie zu spülen.Fügen Sie 100 Mikroliter Primärantikörper in Blockierlösung zu jedem Dia verdünnt, und inkubieren Über Nacht bei vier Grad Celsius. Spülen Sie die Dias mit PBS dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur. Fügen Sie 100 Mikroliter Sekundärantikörper in Blockierlösung verdünnt, und inkubieren für eine Stunde bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt.Spülen Sie in PBS dreimal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur, noch vor Licht geschützt. Um die Dias zu montieren, fügen Sie zwei Tropfen Anti-Fade-Medium mit DAPI auf jeder Folie, Abdeckung mit einem Coverslip, und speichern Sie bei vier Grad Celsius, bis bereit für das Bild. Frontalknochen von Kontrollembryonen waren positiv für pSmad1/5/9, nachgeschaltete BMP-Signalfaktoren und Ki67, einen Zellproliferationsmarker.Bei neuronalen Kamm-spezifischen, konstitutiv aktivierten BMPR1A-mutierten Embryonen wurden jedoch pSmad1/5/9-Spiegel erhöht, während die Ki67-Spiegel verringert wurden. Darüber hinaus wurden in den Frontalknochen mutierter Embryonen mehr apoptotische Zellen beobachtet als bei Kontrollembryonen. Koronale Kryosektionen von gelatineförmigen Köpfen zeigen deutlich DAS GFP-Signal und das RFP-Signal einer tdTomato-Kassette im Nasenknochen- und Nasengewebe, was zeigt, dass Gelatine die fluoreszierenden Signale nicht stört.Wenn diese Abschnitte für SOX9 oder Osterix und E11/Podoplanin immungefärbt wurden, wurden aus den meisten dreiwöchigen harten Geweben hochwertige Abschnitte gewonnen. Auf der anderen Seite wurden mit drei Monate alten Proben nur in einigen der harten Gewebe, einschließlich der trabekulären Fächer des Oberschenkelknochens, des Nasengewebes und des Schädels, einschließlich der Nasen-Premaxilla-Naht und der umgebenden Knochen des Kopfes, hochwertige Abschnitte erhalten. SOX9-positive Zellen wurden speziell in den Chondrozyten der Wachstumsplatte und des Gelenks aus dem Oberschenkelknochen und dem Nasenseptum nachgewiesen.In dem drei Wochen alten Schneidezahn wurde SOX9 in den mesenchymalen Zellen nachgewiesen. Die Doppelfärbungsergebnisse von Osterix und E11 zeigen, dass Osterix bei Osteoblasten nachgewiesen wurde, während E11 bei Osteozyten von Knochen aus dem Oberschenkelknochen und dem Kopf nachgewiesen wurde. Im dreiwöchigen Schneidemittel war Osterix positiv in Odontoblasten, während E11 in follikulären mesenchymalen Zellen positiv war.Überschreiben Sie keine Proben mit 4%PFA. Für das Schnitten von nicht verkalkten harten Geweben in Gelatine, die beste Temperatur ist minus 25 Grad Celsius und niedriger. Nach diesem Verfahren können die Fluoreszenzwerte wie in unserem Protokoll beschrieben quantifiziert werden.Diese Messungen liefern informative Daten, um den Unterschied des relativen Proteinspiegels zwischen verschiedenen Gruppen aufzuzeigen. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für doppel- oder dreifache Färbung, um Koexpressionsmuster verschiedener Proteine zu erhalten. 4%PFA ist gefährlich.Es kann Hautallergien, schwere Augenschäden, Organschäden oder Krebs verursachen. Bitte verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung und waschen Sie die Haut gründlich nach der Handhabung.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automatisierte Quantifizierung Hämatopoetische Zell - Stromal Cell Interactions in histologische Bilder unentkalkte Knochen

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Erzeugenden Primärfibroblastenkulturen von Maus-Ohr und Schwanz Tissues

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Identifizierung kritischer Bedingungen für die Immunfärbung in der Erbsenblattlaus Embryos: Erhöhung Gewebepermeabilität und abnehmender Hintergrundfärbung

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering von humanisierten Knochenmark-Mikroumgebungen in der Maus und ihre Visualisierung durch Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion und koronale Slice Vorbereitung Maus Hypophyse zu entwickeln

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Clonale genetische Tracing mit der Konfetti-Maus zur Untersuchung mineralisierter Gewebe

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...