Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (R01DE020843 से Y.M.), अंतर्राष्ट्रीय FOP एसोसिएशन (Y.M.) द्वारा समर्थित किया गया था, और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31500788 से J.Y.) से सहायता अनुदान.

सभी माउस प्रयोगों मानवीय देखभाल और अनुसंधान में जानवरों के उपयोग को कवर मिशिगन विश्वविद्यालय के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया. इस अध्ययन में प्रयुक्त सभी पशु प्रक्रियाओं को मिशिगन विश्वविद्याल?...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. 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C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

यहाँ हम माउस सिर और undecalified हड्डी के ऊतकों की तैयारी के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, और सेल प्रसार, सेल मौत, और BMP संकेत मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए cryosectioning. हम भी इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों ...

चेहरा मानव पहचान का एक महत्वपूर्ण हिस्सा है, और इस तरह के उपकला, मांसपेशियों, हड्डी, उपास्थि, दांत के रूप में ऊतकों के कई अलग अलग प्रकार से बना है। वे ऊतक सभी तीन रोगाणु परतों से प्राप्त होते हैं: बहिर्चर्म, अंत:चर्म, तथा मध्यजनस्तर1,2. उचित पैटर्न और craniofacial ऊतकों के विकास के लिए, सेल प्रसार, मौत और भेदभाव अत्यधिक समन्वित और विशिष्ट संकेतन रास्ते द्वारा विनियमित होने की जरूरत है, जैसे Wnt, Fgf, Hh और Bmp रास्ते3,4 ,5. कोशिकाओं के प्रसार, अस्तित्व या भेदभाव में दोष craniofacial विकृतियों के लिए नेतृत्व करेंगे, जो सबसे अक्सर होने वाली जन्मजात जन्म दोष के बीच में हैं. ट्रांसजेनिक चूहे कपालीय रूपजनन तथा रोगजनन1,2,3,4,5के तंत्र ों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी साधन हैं . विकास और रोगजनन के दौरान कपालीय संरचनाओं में परिवर्तन को समझना महत्वपूर्ण विकासात्मक सिद्धांतों के साथ-साथ कपालात्मक विकृतियोंकेतंत्र को स्पष्ट करने में मदद करेगा1 ,2,3 ,4,5.
विशिष्ट एंटीबॉडी वाले पूरे माउंट या अनुभागीय ऊतकों का दाग ब्याज 6के प्रोटीन के स्थानिक वितरण का निर्धारण करने के लिए एक अमूल्य तकनीक है . औपचारिक रूप से, ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग या तो इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) या इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) पर भरोसा कर सकते हैं। IHC द्वारा 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) के रूप में एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के साथ उत्पन्न अपारदर्शी प्रतिक्रिया उत्पाद के साथ तुलना में, यदि फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई फ्लोरोसेंट संयुग्मी का उपयोग शामिल है। इसलिए, IF स्पष्ट रूप से पृष्ठभूमि शोर से सकारात्मक कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, और छवियों मात्रात्मक विश्लेषण किया जा करने के लिए अनुमति देता है और इस तरह ImageJ और एडोब फोटोशॉप7,8के रूप में सॉफ्टवेयर द्वारा एक सरल फैशन में बढ़ाया. पूरे माउंट धुंधला दृष्टिकोण ऊतक के छोटे ब्लॉकों पर काम करता है (कम से कम 5 मिमी मोटी), जो वर्गों9से पुनर्निर्माण के लिए आवश्यकता के बिना प्रोटीन के स्थान के बारे में तीन आयामी जानकारी प्रदान कर सकते हैं/ . हालांकि, ऊतक वर्गों के साथ तुलना में, पूरे माउंट इम्यूनोस्टेनिंग समय लेने वाला है और एंटीबॉडी समाधान की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है। नहीं सभी एंटीबॉडी बुनियादी पूरे माउंट दृष्टिकोण के साथ संगत कर रहे हैं. इसके अलावा, एंटीबॉडी के अपूर्ण प्रवेश असमान धुंधला या झूठी नकारात्मक धुंधला में परिणाम होगा. यहाँ हम अनुभागीय ऊतकों पर प्रोटीन/एंटीजन के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित करेंगे। कठोर ऊतकों (जैसे, सिर, दांत, लंबी हड्डी) के लिए, विकास/रोगजनकता के दौरान कैल्शियम जमा करने से नमूना को अनुभाग में मुश्किल हो जाता है और इम्यूनोस्टेनिंग उपचार11,12 केदौरान आसानी से कुल्ला किया जाता है। वर्तमान में उपलब्ध अधिकांश प्रोटोकॉल अनुभागीकरण को आसान बनाने के लिए एम्बेड करने से पहले कठोर ऊतकों को निष्क्रिय कर देते हैं, जो समय लगता है और यदि गलत तरीके से 11,12को संभाला जाए तो नमूनों की आकृति विज्ञान और प्रतिजनों को नष्ट कर सकता है. मुद्दों पर काबू पाने के लिए, हम decalification के बिना कठिन ऊतकों के cryosectioning के लिए एक दृष्टिकोण अनुकूलित, उनकी आकृति विज्ञान और संकेत प्रोटीन के वितरण के बेहतर दृश्य के लिए अग्रणी.
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल बीएमपी ट्रांसजेनिक चूहों के craniofacial ऊतकों में morphometric और हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है. विशेष रूप से, प्रोटोकॉल में शामिल हैं (1) कटाई और विच्छेदन सिर के ऊतकों, (2) अनुभाग और प्रयोगात्मक मार्करों के इम्यूनोस्टेनिंग (Ki67, pSmad1/5/9) TUNEL धुंधला के साथ, (3) फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग वर्गों इमेजिंग, और अंत में (4) विश्लेषण और परिणामों की मात्रा निर्धारित. बिना गणना के कठोर ऊतकों को तैयार करने और क्रायोसेक्शन के प्रोटोकॉल का भीवर्णन 13है . उन तरीकों craniofacial ऊतकों के लिए अनुकूलित कर रहे हैं. वे भी उचित संशोधनों के साथ नमूनों की विभिन्न उम्र से अन्य ऊतकों के लिए लागू होते हैं.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

ऊतक इम्यूनोस्टेनिंग किसी दिए गए ऊतक के भीतर ब्याज के प्रोटीन का अत्यधिक विशिष्ट और विश्वसनीय पता लगाने प्रदान करता है। यहाँ हम उदाहरण के रूप में माउस craniofacial ऊतकों का उपयोग craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए एक पूर्ण और सरल प्रोटोकॉल का वर्णन. प्रोटोकॉल की तैयारी और ऊतकों के cryosectioning के होते हैं, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस, छवि अधिग्रहण, और परिमाणीकरण. इसके अलावा, इम्यूनोस्टेनिंग के लिए undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और क्रायोसेक्शनिंग के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है, उदाहरण के रूप में craniofacial ऊतकों और लंबी हड्डियों का उपयोग कर। उन विधियों को प्रोटीन अभिव्यक्ति और craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान विभिन्न ऊतकों में आकृतिक /परमाणु परिवर्तन निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। वे भी उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों के लिए लागू होते हैं. ऊतक विज्ञान और वर्गों के उच्च गुणवत्ता का ज्ञान प्रयोगात्मक परिणामों से वैज्ञानिक निष्कर्ष आकर्षित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. इस पद्धति की संभावित सीमाओं में शामिल हैं, लेकिन एंटीबॉडी की विशिष्टता और परिमाणीकरण की कठिनाइयों तक ही सीमित नहीं हैं, जिन पर यहां भी चर्चा की गई है।

भ्रूण कपालीय ऊतक अनुभाग उपरोक्त चरणों के बाद, सिर नियंत्रण से विच्छेदित किया गया (पी 0-Cre) या उत्परिवर्ती (संस्थित सक्रिय Bmpr1a तंत्रिका शिखर कोशिकाओं में, P0-Cre; caBmpr1a) भ्रूण दिन में भ्र...

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

ऊतक तैयारी और माउस Craniofacial ऊतकों और undecalified हड्डी के इम्यूनोस्टेनिंग

यहाँ, हम उदाहरण के रूप में माउस craniofacial ऊतकों का उपयोग करके craniofacial morphogenesis/pathogenesis के दौरान प्रोटीन के स्तर का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इसके अलावा, हम प्रतिरक्षा के लिए युवा चूहों से undecalified कठोर ऊतकों की तैयारी और cryosectioning के लिए एक विधि का वर्णन.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

यहां, हम खंडित सामग्रियों पर प्रोटीन पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के लिए अपना सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस विधि को एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं है। हम दुविधा में पड़ा हुआ कठोर ऊतकों सहित माउस सिर का उपयोग करेंगे।इस तकनीक का मुख्य लाभ एंटीजन पुनर्प्राप्ति और कठोर ऊतकों के डिक्लेक्टिफिकेशन को छोड़ना है। वे इम्यूनोस्टेपिंग परिणामों की एक अच्छी गुणवत्ता के लिए नेतृत्व करते हैं । इस विधि से समय और श्रम दोनों की बचत भी होती है।यह विधि उचित संशोधनों के साथ अन्य ऊतकों पर भी लागू होती है। दुविधा में पड़ा हुआ ऊतकों से अच्छा वर्ग बनाने के लिए, आसपास के ऊतकों को ट्रिम करने के लिए अपने लक्षित ऊतकों को आगे काटना, और यदि आवश्यक हो तो क्रायोप्रोटेक्शन से पहले दो दिनों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर 10% EDTA के साथ नमूनों का इलाज करें। दृश्य प्रदर्शन इस विधि की प्रक्रिया का एक विस्तृत और स्पष्ट विवरण प्रदान करता है।शुरू करने के लिए, एक 10 सेंटीमीटर और कई ३.५ सेंटीमीटर PBS युक्त व्यंजन और एक 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्रत्येक गर्भवती माउस के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से PBS में 4% पीएफए के दो मिलीलीटर युक्त थाली तैयार है, और उन सब को बर्फ पर जगह है । गर्भवती चूहों से भ्रूण विच्छेदन करने के लिए, संदंश के साथ एक इच्छामृत्यु माउस के पेट के केंद्र के नीचे त्वचा को पकड़ो, केवल त्वचा के माध्यम से काटा, और फिर धीरे से त्वचा पर खींचने के लिए यह अंतर्निहित पेट की मांसपेशियों की दीवार से अलग । त्वचा चीरा की एक ही रेखा के बाद, पेट गुहा में कटौती।भ्रूण की एक स्ट्रिंग युक्त गर्भाशय निकालें। फिर, गर्भाशय की दीवार को धीरे-धीरे काटकर भ्रूण को हटा दें, जो जर्दी थैली और एमनियन जैसे एक्सपेरिमेंटिक ऊतकों को हटा देगा। कट और प्रत्येक भ्रूण से सिर को अलग, और संदंश के साथ एक 12 अच्छी तरह से 4% पीएफए युक्त थाली के एक अलग अच्छी तरह से प्रत्येक सिर हस्तांतरण ।चार घंटे तक चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट को ठीक किया। 12 घंटे के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ चार डिग्री सेल्सियस पर PBS में सिर कुल्ला । सिर को क्रायोप्रोटेक्ट करने के लिए, पीबीएस में 30% सुक्रोज के दो मिलीलीटर युक्त एक नई 12-अच्छी प्लेट में संदंश का उपयोग करके उन्हें स्थानांतरित करें।चार डिग्री सेल्सियस पर कोमल आंदोलन के साथ इनक्यूबेट जब तक सिर पकवान के नीचे करने के लिए सिंक । क्रायोसंरक्षित सिर को एम्बेड करने के लिए, उन्हें इष्टतम कटिंग टेम्परेचर कंपाउंड युक्त मोल्ड में स्थानांतरित करें, और कई मिनटों के लिए संतुलन रखें। संदंश का उपयोग करना, नमूनों के स्थान और दिशा को समायोजित करें ताकि नमूनों की छंटनी की गई पक्ष एम्बेडिंग मोल्ड के नीचे का सामना करे।फिर, फ्रीज करने के लिए सूखी बर्फ पर मोल्ड रखें, और क्रायोस्ेक्शनिंग के लिए तैयार होने तक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर प्लास्टिक बैग में स्टोर करें। प्रसवोत्तर ऊतक के लिए, त्वचा को हटाने और एक इच्छामृत्यु के ऊतकों को एडीपोज करने के बाद, तीन सप्ताह से तीन महीने पुराने माउस, सिर को काटते और अलग करते हैं और मंडीबल को हटा देते हैं। फिर, भ्रूण के सिर के साथ किए गए सिर को ठीक करें और क्रायोप्रोटेक्ट करें।अक्टूबर में भ्रूण सिर के रूप में एक समान तरीके से 8% जिलेटिन में एम्बेड, और क्रायोमोल्ड्स को एक प्लास्टिक बैग में शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोम्बेक्शन तक रखें। उपयुक्त क्रायोस्टेट तापमान निर्धारित करें। क्रायोस्टेट तापमान को बराबर करने के लिए नमूनों को क्रायोस्टेट कक्ष में लगभग 30 मिनट तक रखें।क्रायोमोल्ड से नमूने के साथ ब्लॉक निकालें, और नमूना चक पर एक अक्टूबर ड्रॉप के साथ माउंट और इसे फ्रीज, चक से दूर नमूना के छंटनी पक्ष रखने के लिए और ऑपरेटर का सामना करना पड़ सुनिश्चित कर रही है । क्रायोस्टेट ऑब्जेक्ट होल्डर पर ब्लॉक-माउंटेड चक लोड करें। ब्लेड धारक को समायोजित करें ताकि ब्लेड एंगल नमूने के सापेक्ष तीन से पांच डिग्री हो।लेपित माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 10 माइक्रोमीटर सेक्शन लीजिए। कमरे के तापमान पर वर्गों को पूरी तरह से सूखने तक छोड़ दें, और फिर उन्हें शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। धुंधला के साथ शुरू करने के लिए, शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस से स्लाइड बाहर ले, और उन्हें एक घंटे के लिए कमरे के तापमान पर रखने के लिए हवा से सूखी वर्गों।अक्टूबर को धोने और वर्गों को पार करने के लिए पांच मिनट के लिए तीन बार 0.1% पीबीएसटी में स्लाइड कुल्ला। प्रत्येक स्लाइड में अवरुद्ध समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। फिर, स्लाइड को रिंस किए बिना अवरुद्ध समाधान निकालें।प्रत्येक स्लाइड के समाधान को अवरुद्ध करने में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें। कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए तीन बार PBS के साथ स्लाइड कुल्ला । समाधान को अवरुद्ध करने में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।पीबीएस में कमरे के तापमान पर 10 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार कुल्ला, अभी भी प्रकाश से संरक्षित । स्लाइड्स माउंट करने के लिए, प्रत्येक स्लाइड पर DAPI के साथ एंटी-फीका माध्यम की दो बूंदें जोड़ें, एक कवरलिप के साथ कवर करें, और छवि के लिए तैयार होने तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। नियंत्रण भ्रूण के ललाट हड्डियों pSmad1/5/9, डाउनस्ट्रीम बीएमपी संकेत कारकों के लिए सकारात्मक थे, और Ki67, एक सेल प्रसार मार्कर ।तंत्रिका शिखा-विशिष्ट में, संविलियन सक्रिय BMPR1A उत्परिवर्ती भ्रूण, हालांकि, pSmad1/5/9 के स्तर में वृद्धि हुई थी, जबकि Ki67 के स्तर में कमी आई थी । इसके अलावा, नियंत्रण भ्रूण की तुलना में उत्परिवर्ती भ्रूण की ललाट हड्डियों में अधिक एपोटोटिक कोशिकाओं को देखा गया। जिलेटिन-एम्बेडेड सिर के कोरोनल क्रायोसेक्शन स्पष्ट रूप से नाक की हड्डी और नाक के ऊतकों में एक टीडीटोमाटो कैसेट से जीएफपी सिग्नल और आरएफपी सिग्नल दिखाते हैं, यह प्रदर्शित करते हैं कि जिलेटिन फ्लोरोसेंट संकेतों में हस्तक्षेप नहीं करता है।जब इन वर्गों SOX9 या Osterix और E11/Podoplanin के लिए इम्यूनो दाग थे, अच्छी गुणवत्ता वर्गों तीन सप्ताह के कठिन ऊतकों के अधिकांश से प्राप्त किया गया । दूसरी ओर, तीन महीने पुराने नमूनों के साथ, अच्छी गुणवत्ता वाले वर्गों को केवल कुछ कठोर ऊतकों में प्राप्त किया गया था, जिसमें फीमर के ट्रैबेकुलर डिब्बे, नाक के ऊतक और खोपड़ी शामिल थे, जिसमें नाक-प्रीमैक्सिला सीवन और सिर की आसपास की हड्डियां शामिल थीं । SOX9-सकारात्मक कोशिकाओं को विशेष रूप से विकास प्लेट के chondrocytes और फीमर और नाक पट से संयुक्त में पाया गया ।तीन सप्ताह पुराने चीरा में, SOX9 mesenchymal कोशिकाओं में पाया गया था । ओस्टेरिक्स और E11 डबल धुंधला परिणाम बताते हैं कि ओस्टेरिक्स का पता ऑस्टियोब्लास्ट में लगाया गया था, जबकि E11 को फीमर और सिर से हड्डियों के ऑस्टियोसाइट्स में पाया गया था । तीन सप्ताह के छेदक में ओस्टेरिक्स ओडोन्टोब्लास्ट्स में पॉजिटिव था, जबकि E11 कूप मेसेंकिमल कोशिकाओं में सकारात्मक था ।कृपया 4% पीएफए के साथ नमूनों को ओवरफिक्स न करें। जिलेटिन में दुविधा में पड़ा हुआ कठोर ऊतकों की धारा के लिए, सबसे अच्छा तापमान शून्य से 25 डिग्री सेल्सियस और कम है। इस प्रक्रिया के बाद, फ्लोरेसेंस के स्तर को हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में निर्धारित किया जा सकता है।वे माप विभिन्न समूहों के बीच प्रोटीन के सापेक्ष स्तर के अंतर को दिखाने के लिए सूचनात्मक डेटा प्रदान करेंगे । इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने विभिन्न प्रोटीन के सह-अभिव्यक्ति पैटर्न प्राप्त करने के लिए डबल या ट्रिपल धुंधला करने का मार्ग प्रशस्त किया। 4% पीएफए खतरनाक है।यह त्वचा एलर्जी, गंभीर आंखों को नुकसान, अंग क्षति, या कैंसर का कारण बन सकता है। कृपया व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करें, और हैंडलिंग के बाद त्वचा को अच्छी तरह से धोएं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

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Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

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Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

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खनिजीकृत ऊतकों का अध्ययन करने के लिए Confetti माउस का उपयोग कर क्लोनल आनुवंशिक अनुरेखण

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Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

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Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...