Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
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이 작품은 국립 보건원 (R01DE020843 ~ Y.M.), 국제 FOP 협회 (Y.M.), 중국 국립 자연 과학 재단 (31500788 ~ J.Y.)의 보조금 지원으로 지원되었습니다.

모든 마우스 실험은 연구에서 동물의 인도적 관리 및 사용을 다루는 미시간 대학 지침에 따라 수행되었다. 이 연구에서 사용된 모든 동물 절차는 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 #PRO00007715).
1. 조직 준비
<ol><li>
배아 조직의 준비
	<ol>
<li>10cm 접시 1개, 인산완충식염수(PBS)를 함유한 3.5cm 접시 1개, 임신한 마우?...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

여기에서 우리는 마우스 헤드 및 dedecalcified 뼈 조직의 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 세포 증식, 세포 사멸 및 BMP 신호 마커의 면역 염색을 위한 냉동 부피. 우리는 또한 면역 형광 이미지에서 정량적 데이터를 얻기위한 전략을 자세히 설명합니다. 그 방법은 또한 적절한 수정을 가진 그밖 조직에 적용될 수 있습니다.
조직 준비를위한 조건은 조직의 크기와 유형에 ...

얼굴은 인간 정체성의 중요한 부분이며 상피, 근육, 뼈, 연골, 치아와 같은 여러 가지 유형의 조직으로 구성됩니다. 그 조직은 모든 3개의 세균 층에서 파생됩니다: ectoderm, 내배엽및 중배엽 1,2. 두개안면 조직의 적절한 패터닝 및 개발을 위해서는 Wnt, Fgf, Hh 및 Bmp 경로3,4와 같은 특정 신호 경로에 의해 세포 증식, 사망 및 분화가 고도로 조정되고 조절되어야 합니다. ,5. 세포의 증식, 생존 또는 분화의 결함은 가장 자주 발생하는 선천성 선천성 선천적 인 결함 중 하나 인 두개안면 기형으로 이어질 것입니다. 형질전환 마우스는 두개안면 형태 형성 및 병인의 메커니즘을연구하는 데 유용한 도구1, 2,3,4,5. 발달과 병인 동안 두개안면 구조의 변화를 이해하는 것은 주요 발달 원리뿐만 아니라 두개안면 기형의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 것입니다1,2,3 ,4,5.
특정 항체를 가진 전체 마운트 또는 단면 조직의 염색은 관심 있는 단백질의 공간 분포를 결정하기 위한 귀중한 기술이다 6. 공식적으로, 조직 면역 염색은 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 형광 (IF)에 의존 할 수 있습니다. IHC에 의해 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)과 같은 발색성 기질로 생성된 불투명 반응 생성물과 비교하여, IF는 형광 현미경 검사법에 의해 보이는 형광 접합체의 사용을 포함한다. 따라서 IF는 배경 잡음으로부터 양성 세포를 명확하게 구별할 수 있으며, ImageJ 및 Adobe Photoshop7,8과같은 소프트웨어에 의해 이미지를 정량적으로 분석하고 향상시킬 수 있다. 전체 마운트 염색 접근법은 작은 조직 블록 (두께 5mm 미만)에서 작동하며섹션9, 10에서 재건 할 필요없이 단백질 / 항원의 위치에 대한 3 차원 정보를 제공 할 수있습니다. . 그러나, 조직 단면도와 비교해, 전체 마운트 면역 염색은 시간이 오래 걸리고 항체 해결책의 대량을 요구합니다. 모든 항체가 기본 전체 마운트 접근법과 호환되는 것은 아닙니다. 또한, 항체의 불완전한 침투는 고르지 못한 염색 또는 거짓 음성 염색을 초래할 것이다. 여기에서 우리는 단면조직에 단백질/항원의 면역형광 검출에 집중할 것입니다. 단단한 조직(예를 들어, 머리, 치아, 긴 뼈)의 경우, 발달/병인 동안 칼슘 침착은 면역 염색 치료 동안 시료를 단면화하기 어렵게 하고 쉽게 헹구게 한다11,12. 현재 이용 가능한 대부분의 프로토콜은 절편을 쉽게 하기 위해 삽입하기 전에 단단한 조직을 decalcify, 이는 시간이 많이 걸리고 부적절하게 처리하는 경우 샘플의 형태 및 항원을 파괴 할 수있다11,12. 문제를 극복하기 위해, 우리는 decalcification없이 단단한 조직의 냉동 절제에 대한 접근 방식을 최적화, 그들의 형태와 신호 단백질의 분포의 개선 시각화로 이어지는.
여기서 기술된 프로토콜은 BMP 형질전환 마우스의 두개안면 조직에서 형태측정 및 조직학적 변화를 결정하는 데 사용되고 있다. 구체적으로, 이 프로토콜은 (1) 두체 조직을 수확및 해부하는 것, (2) 실험 마커의 절편 및 면역염색(Ki67, pSmad1/5/9)과 TUNEL 염색, (3) 형광 현미경을 사용하여 단면을 이미징하고, 마지막으로 (4) 결과를 분석하고 정량화합니다. 탈석없이 경조직을 준비하고 저온절하는 프로토콜도기재되어있다. 그 방법은 두개안면 조직에 최적화되어 있습니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 견본의 각종 나이에서 그밖 조직에 적용가능합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

조직 면역 염색은 주어진 조직 내의 관심 있는 단백질의 고도로 특이하고 믿을 수 있는 검출을 제공합니다. 여기에서 우리는 예를 들면 마우스 두개안면 조직을 사용하여 두개안면 형태 형성/병인 도중 단백질 발현을 검출하는 완전하고 간단한 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 조직의 준비 및 냉동 부피, 간접 면역 형광, 이미지 수집 및 정량화로 구성됩니다. 또한 면역 염색을위한 비해짐 경조직의 준비 및 냉동 절제 방법은 두개안면 조직과 긴 뼈를 예로 들수 있습니다. 그 방법은 두개안면 형태 형성/병인 동안 다양한 조직에서 단백질 발현 및 형태학적/해부학적 변화를 결정하는 데 핵심적인 것입니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 그밖 조직에 적용가능합니다. 연구 결과에 대한 지식과 섹션의 높은 품질은 실험 결과에서 과학적 결론을 도출하는 데 중요합니다. 이 방법론의 잠재적 한계는 항체의 특이성 및 정량화의 어려움에 한정되지 않으나, 이는 또한 여기에서 논의된다.

배아 두개안면 조직 섹션 상기 단계에 따라, 머리는 배아의 날(E) 16.5 또는 18.5에서대조군(P0-Cre)또는 돌연변이체(신경 문장 세포에서 Bmpr1a, P0-Cre; caBmpr1a)에서배아를 해부하였다. 4 시간 동안 4 % PFA에 고정 한 후, 샘플을 OCT에 내장하고 코로나절하였다. 결과된 절편은 프로토콜에 따라 항원 검색 없이 pSmad1/5/9(다운스트림 BMP 신호 인자) 또는 Ki67(세?...

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Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

여기서는 단면 물질에 대한 단백질에 대한 면역 형광 검출을 위한 간단한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 항원 회수가 필요하지 않습니다. 우리는 변형되지 않은 단단한 조직을 포함하여 마우스 머리를 사용합니다.이 기술의 주요 장점은 항원 회수 및 하드 조직의 탈화를 건너 뛰는 것입니다. 그 면역 염색 결과의 좋은 품질로 이어질. 이 방법은 또한 시간과 노동을 모두 절약합니다.이 방법은 적절한 수정이 가능한 다른 조직에도 적용됩니다. 탈균되지 않은 조직에서 좋은 섹션을 만들려면 대상 조직을 더 해부하여 주변 조직을 다듬고 필요한 경우 냉동 보호 전에 2 일 동안 섭씨 4도에서 10 %EDTA로 샘플을 치료하십시오. 시각적 데모는 이 방법의 절차에 대한 상세하고 명확한 설명을 제공합니다.우선, PBS가 포함된 10센티미터 및 3.5센티미터 요리 1개와 임신한 마우스 각각의 4%PFA 2밀리리터를 포함하는 12웰 배양 플레이트 1개를 PBS에 각각 양으로 준비하고 모두 얼음 위에 놓습니다. 임신 한 마우스에서 배아를 해부하려면, 집게와 안락사 마우스의 배의 중심 아래 피부를 잡아, 피부를 통해 잘라, 다음 부드럽게 기본 복근 벽에서 분리 피부를 당겨. 피부 절개의 동일한 라인을 따라, 복강으로 잘라.배아의 문자열을 포함하는 자궁을 제거합니다. 그런 다음, 자궁 벽을 부드럽게 절단하여 배아를 제거하여 노른자 낭및 양막과 같은 외화 조직을 제거합니다. 각 배아로부터 머리를 자르고 분리하고, 집게가 각 머리를 4%의 PFA를 포함하는 12웰 플레이트의 분리된 우물로 옮기는다.4시간 동안 섭씨 4도에서 배양하여 수정합니다. 12시간 동안 부드러운 흔들림으로 PBS에서 머리를 섭씨 4도에서 헹구는 다. 머리를 보호하려면 PBS에서 30 % 자당 2 밀리리터가 들어있는 새로운 12 웰 플레이트로 집게를 사용하여 전송하십시오.머리가 접시의 바닥에 가라 앉을 때까지 섭씨 4도에서 부드러운 동요로 배양하십시오. 냉동 보호 헤드를 포함하려면 최적의 절삭 온도 화합물이 들어있는 금형으로 옮기고 몇 분 동안 평형합니다. 집게를 사용하여 샘플의 트리밍 측이 포함 금형의 바닥을 향하도록 샘플의 위치와 방향을 조정합니다.그런 다음 금형을 드라이 아이스에 놓고 동결하고 냉동 절전을 준비할 때까지 비닐 봉지에 섭씨 영하 80도에 보관하십시오. 산후 조직의 경우, 안락사된 3개월에서 3개월까지의 마우스의 피부와 조직을 제거한 후 머리를 자르고 분리하고 하악을 제거합니다. 그런 다음, 배아 헤드와 같이 머리를 고정하고 냉동 보호합니다.10월에 배아 헤드와 비슷한 방식으로 8%젤라틴을 포함하고, 극저온이 저온까지 영하 80도의 비닐봉지에 극저온을 보관합니다. 적절한 저온 온도를 설정합니다. 저온 온도에 평형하기 위해 약 30 분 동안 냉동 챔버에 샘플을 놓습니다.Cryomold의 샘플로 블록을 제거하고 10월 드롭을 시편 척에 장착하여 동결하여 샘플의 트리밍 된 면을 척에서 가장 멀리 유지하고 작업자를 향하도록하십시오. 블록 장착 척을 극저스트 오브젝트 홀더에 로드합니다. 블레이드 홀더를 조정하여 블레이드 각도가 시료에 비해 3~5도되도록 합니다.코팅 된 현미경 슬라이드에 10 마이크로 미터 섹션을 수집합니다. 완전히 건조 할 때까지 실온에서 섹션을 두고, 다음 영하 80도에서 저장합니다. 염색으로 시작하려면 영하 80도에서 슬라이드를 꺼내 실온에서 1 시간 동안 유지하여 섹션을 공기 건조시하십시오.슬라이드를 0.1%PBST로 3회 3회 헹구어 각 5분간 10월을 씻어내고 섹션을 투과화합니다. 각 슬라이드에 블로킹 솔루션 200마이크로리터를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 슬라이드를 헹구지 않고 차단 용액을 제거합니다.각 슬라이드에 차단 용액에 희석 된 1 차 성 항체의 100 마이크로 리터를 추가하고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 실온에서 각각 10분 동안 PBS로 슬라이드를 세 번 헹구십시오. 차단 용액에 희석된 이차 항체 100마이크로리터를 추가하고, 빛으로부터 보호되는 실온에서 1시간 동안 배양합니다.실온에서 각각 10분 동안 PBS에서 세 번 헹구면 여전히 빛으로부터 보호됩니다. 슬라이드를 장착하려면 각 슬라이드에 DAPI가 있는 페이드 방지 매체 2방울을 추가하고 커버슬립으로 덮고 이미지준비될 때까지 섭씨 4도에 저장합니다. 대조군 배아의 정면 골격은 pSmad1/5/9, 다운스트림 BMP 신호인자 및 세포 증식 마커인 Ki67에 대해 양성이었습니다.신경 문장 별에서, 구성적으로 활성화 된 BMPR1A 돌연변이 배아, 그러나, PSmad1/5/9 수준은 Ki67 수준이 감소하는 동안 증가했다. 더욱이, 더 많은 세포세포는 대조군 배아의 세포보다는 돌연변이 배아의 정면 뼈에서 관찰되었다. 젤라틴 임베디드 헤드의 관상 극저섹션은 비강 뼈와 비강 조직의 tdTomato 카세트에서 GFP 신호 및 RFP 신호를 명확하게 보여주며 젤라틴이 형광 신호를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다.이러한 섹션이 SOX9 또는 Osterix 및 E11/Podoplanin에 대해 면역 염색되었을 때, 3주 간의 단단한 조직의 대부분에서 양질의 섹션을 얻을 수 있었습니다. 한편, 3개월 된 시료로, 대퇴골의 궤적 구획, 비강 조직, 두개골 등 일부 단단한 조직에서만 양질의 섹션을 얻을 수 있었는데, 여기에는 비강-프리맥스야 봉합사및 머리의 주변 뼈가 포함되었다. SOX9 양성 세포는 대퇴골과 비강 중격으로부터 성장판과 조인트의 연골세포에서 구체적으로 검출되었다.3주 된 절개에서 SOX9는 중간엽 세포에서 검출되었습니다. Osterix와 E11 이중 염색 결과 Osterix는 골세포에서 검출된 것을 보여주고, E11은 대퇴골과 머리에서 뼈의 골다귀에서 검출되었습니다. 3 주 절개에서, Osterix는 오돈토 블라스트에서 긍정적이었다, E11여포 중간 엽 세포에서 긍정적이었다 동안.4%의 PFA로 샘플을 과대수정하지 마십시오. 젤라틴에서 탈균화되지 않은 단단한 조직의 단면에 대 한, 최고의 온도 영하 25 섭씨 낮은. 이 절차에 따라, 형광의 수준은 우리의 프로토콜에 설명된 대로 정량화될 수 있습니다.이러한 측정은 서로 다른 그룹 간의 단백질의 상대적 수준의 차이를 보여주기 위해 유익한 데이터를 제공합니다. 개발 후, 이 기술은 다른 단백질의 공동 발현 패턴을 얻기 위해 이중 또는 삼중 염색을위한 길을 열었습니다. 4% PFA는 위험합니다.그것은 피부 알레르기, 심각한 눈 손상, 장기 손상, 또는 암을 일으킬 수 있습니다. 취급 후 개인 보호 장비를 사용하고 피부를 철저히 씻어 주세요.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

조혈 세포의 자동화 된 정량화 - Undecalcified 뼈의 조직 학적 이미지에서 기질 세포 상호 작용

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

연구

발생학

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

마우스 귀와 꼬리 조직에서 생성 차 섬유 아세포 배양

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

완두콩 진딧물 태아의 면역 염색을위한 중요한 조건의 확인 : 조직 투과성을 증가 및 배경 염색을 감소

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

해 부 및 마우스 뇌 개발의 코로나 슬라이스 준비

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

신경 문장 세포 박리 및 이동의 연구를 위한 마우스에서 1 차적인 두개골 신경 문장 세포의 해부, 문화 및 분석

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

광물화된 조직을 연구하기 위해 색종이 마우스를 사용한 클로날 유전자 추적

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

유전자 발현 분석을 위한 마우스 배아 연골 및 뼈의 레이저 포획 미세 해부

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...