Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01DE020843 til Y.M.), International FOP Association (Y.M.), og en stipend-i-bistand fra National Natural Science Foundation i Kina (31500788 til J.Y.).

Alle musen eksperimenter ble utført i samsvar med University of Michigan retningslinjer dekker Human omsorg og bruk av dyr i forskning. Alle dyr prosedyrer som brukes i denne studien ble godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved University of Michigan (protokoll #PRO00007715).
1. vevs forberedelser
<ol><li>
Utarbeidelse av embryonale vev
	<ol>
<li>Forbered 1 10 cm parabol og flere 3,5 cm retter som inneholder fosfat bufret saltvann (PBS), og 1 12-...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

Her gir vi en detaljert protokoll for utarbeidelse av mus hodet og undecalcified bein vev, og kryosnitt for immunostaining av celle spredning, celle død, og BMP signalering markører. Vi har også detaljert informasjon om strategien for innhenting av kvantitative data fra immunofluorescent bilder. Disse metodene kan også gjelde for andre vev med passende modifikasjoner.
Betingelser for vevs forberedelser varierer etter størrelse og type vev. Fiksering og cryoprotection tid vanligvis trenger...

Ansiktet er en viktig del av menneskets identitet, og er sammensatt av flere forskjellige typer vev, som epitel, muskler, bein, brusk, tann. Disse vev er avledet fra alle tre bakterie lag: ektoderm, endoderm, og mesoderm1,2. For riktig mønster og utvikling av kraniofacial vev, celle spredning, død og differensiering må være svært koordinert og regulert av spesifikke signalering veier, for eksempel wnt, FGF, HH og BMP trasé3,4 ,5. Defekter i spredning, overlevelse eller differensiering av celler vil føre til kraniofacial misdannelser, som er blant de hyppigst forekommende medfødte misdannelser. Transgene mus er nyttige verktøy for å studere mekanismer for kraniofacial morphogenesis og patogenesen1,2,3,4,5. Forstå endringene i kraniofacial strukturer under utvikling og patogenesen vil bidra til å avklare viktige utviklingsmessige prinsipper samt mekanismer for kraniofacial misdannelser1,2,3 ,4,5.
Den farging av hele montere eller delt vev med spesifikke antistoffer er en uvurderlig teknikk for å bestemme romlig fordeling av proteiner av interesse 6. Formelt kan vevs immunostaining stole enten på immunhistokjemi (IHC) eller immunofluorescence (IF). Sammenlignet med den ugjennomsiktige reaksjons produkt generert med et kromogen substrat som 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) med IHC, hvis innebærer bruk av fluorescerende konjugater synlig ved fluorescens mikroskopi. Derfor, hvis kan tydelig skille positive celler fra bakgrunnsstøy, og lar bildene skal kvantitativt analysert og forbedret på en enkel måte av programvare som ImageJ og Adobe Photoshop7,8. Hele Mount farging tilnærmingen fungerer på små blokker av vev (mindre enn 5 mm tykk), som kan gi tredimensjonal informasjon om plasseringen av proteiner/antigener uten behov for rekonstruksjon fra avsnitt9,10 . Men sammenlignet med vev seksjoner, hele Mount immunostaining er tidkrevende og krever store mengder antistoff løsninger. Ikke alle antistoffer er kompatible med den grunnleggende hele monterings tilnærmingen. I tillegg vil ufullstendig inntrengning av antistoffer føre til ujevne flekker eller falske negative flekker. Her vil vi fokusere på immunofluorescence deteksjon av proteiner/antigener på delt vev. For hardt vev (f. eks, hode, tann, lange ben), kalsium avsetning under utvikling/patogenesen gjør prøven vanskelig å delen og lett skylles av under immunostaining behandling11,12. De fleste av de tilgjengelige protokollene avkalke hard vev før innebygging for å gjøre snitting enklere, noe som er tidkrevende og kan ødelegge morfologi og antigener av prøver hvis håndteres feil11,12. For å overkomme problemene, optimaliserte vi en tilnærming for kryosnitt av hardt vev uten Avkalking, noe som fører til forbedret visualisering av deres morfologi og distribusjon av signalering proteiner.
Protokollen som beskrives her, brukes til å bestemme morphometric og histologiske endringer i det kraniofacial vevet i BMP transgene mus. Nærmere bestemt inkluderer protokollen (1) høsting og dissekere hodet vev, (2) seksjon og immunostaining av eksperimentelle markører (Ki67, pSmad1/5/9) sammen med TUNEL farging, (3) Imaging avsnittene ved hjelp av fluorescens mikroskop, og til slutt (4) analysere og kvantifisere resultatene. Protokollen til å forberede og cryosection hardt vev uten avkalking er også beskrevet13. Disse metodene er optimalisert for kraniofacial vev. De er også gjeldende for andre vev fra ulike aldre av prøver med passende modifikasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

Tissue immunostaining gir svært spesifikk og pålitelig påvisning av proteiner av interesse innenfor et gitt vev. Her beskriver vi en komplett og enkel protokoll for å oppdage protein uttrykk under kraniofacial morphogenesis/patogenesen ved hjelp av mus kraniofacial vev som eksempler. Protokollen består av utarbeidelse og kryosnitt av vev, indirekte immunofluorescence, bildeoppkjøp, og kvantifisering. I tillegg er en metode for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified hardt vev for immunostaining beskrevet, ved hjelp av kraniofacial vev og lange bein som eksempler. Disse metodene er nøkkelen til å bestemme protein uttrykk og morfologiske/anatomiske endringer i ulike vev under kraniofacial morphogenesis/patogenesen. De gjelder også for andre vev med passende modifikasjoner. Kunnskap om histologi og høy kvalitet på seksjoner er avgjørende for å trekke vitenskapelige konklusjoner fra eksperimentelle utfall. Potensielle begrensninger av denne metodikken inkluderer men er ikke begrenset til spesifisitet av antistoffer og vanskeligheter med kvantifisering, som også diskuteres her.

Embryonale kraniofacial vev seksjoner Etter trinnene ovenfor, var hodene dissekert fra kontroll (p0-grobunn) eller mutant (Constitutively aktivert Bmpr1a i neural Crest celler, p0-grobunn; caBmpr1a) embryo på embryonale dagen (E) 16,5 eller 18,5. Etter innfesting i 4% PFA for 4 h, prøvene ble innebygd i OCT og cryosectioned koronalt. Resulterte seksjoner ble immunostained med antistoffer mot pSmad1/5/9 (nedstrøms BMP signalering faktorer) eller Ki6...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vev forberedelse og Immunostaining av mus Kraniofacial vev og Undecalcified Bone

Her presenterer vi en detaljert protokoll for å oppdage og kvantifisere proteinnivåer under kraniofacial morphogenesis/patogenesen av immunostaining ved hjelp av musen kraniofacial vev som eksempler. I tillegg beskriver vi en metode for utarbeidelse og kryosnitt av undecalcified harde vev fra unge mus for immunostaining.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Her presenterer vi vår enkle protokoll for immunofluorescence deteksjon på proteiner på seksjonerte materialer. Denne metoden krever ikke antigenhenting. Vi vil bruke musehoder, inkludert uberegnet hardt vev.Den største fordelen med denne teknikken er å hoppe over antigenhenting og avkalking av hardt vev. De fører til en god kvalitet på immunstaining resultater. Denne metoden sparer også både tid og arbeid.Denne metoden gjelder også for andre vev med passende modifikasjoner. For å lage fine seksjoner fra uberegnet vev, dissekere målvevet ytterligere for å trimme omkringliggende vev, og om nødvendig behandle prøvene med 10% EDTA ved fire grader Celsius i to dager før kryobeskyttelse. Visuell demonstrasjon gir en detaljert og klar forklaring på prosedyren for denne metoden.Til å begynne med kan du tilberede en 10-centimeter og flere 3,5 centimeter høye retter som inneholder PBS og en 12-brønns kulturplate som inneholder to milliliter med 4 % PFA i PBS i hver brønn for hver gravide mus, og legg dem alle på is. For å dissekere embryoer fra gravide mus, ta huden under midten av magen til en eutanisert mus med tang, kutt bare gjennom huden, og trekk deretter forsiktig på huden for å skille den fra den underliggende bukmuskelveggen. Etter samme linje av hud snittet, skåret inn i bukhulen.Fjern livmoren som inneholder en streng av embryoer. Fjern deretter embryoene ved å forsiktig kutte bort livmorveggen, som vil fjerne det ekstraembryoniske vevet som eggeplommeseken og amnion. Klipp og isolere hodet fra hvert embryo, og med tang overføre hvert hode til en egen brønn av en 12-brønns plate som inneholder 4%PFA.Inkuber ved fire grader Celsius i fire timer for å fikse. Skyll hodene i PBS ved fire grader Celsius med mild risting i 12 timer. For å kryobeskytte hodene, overfør dem ved hjelp av tang til en ny 12-brønns plate som inneholder to milliliter på 30% sukrose i PBS.Inkuber med mild agitasjon ved fire grader Celsius til hodene synker til bunnen av parabolen. For å bygge inn de kryobeskyttede hodene, overfør dem til en mugg som inneholder Optimal Cutting Temperature Compound, og likevekt i flere minutter. Bruk tang til å justere plasseringen og retningen på prøvene slik at den trimmede siden av prøvene vender mot bunnen av innebyggingsformen.Deretter plasserer du formen på tørris for å fryse, og oppbevares i en plastpose på minus 80 grader Celsius til den er klar for kryoseksjon. For postnatal vev, etter å ha fjernet huden og fettvev av en eutanisert, tre uker til tre måneder gammel mus, kutt og isolere hodet og fjern mandible. Deretter fikser og kryobeskytter hodet som gjort med embryohoder.Bygg inn 8% gelatin på samme måte som embryohoder i OKTOBER, og hold Cryomolds i en plastpose på minus 80 grader Celsius til kryoseksjon. Still inn riktig kryostattemperatur. Plasser prøvene i kryostatkammeret i ca. 30 minutter for å likevekte til kryostattemperaturen.Fjern blokken med prøven fra Cryomold, og monter den med en OCT-dråpe på prøvetucken og frys den, og pass på å holde den trimmede siden av prøven lengst fra chucken og vendt mot operatøren. Legg den blokkmonterte chucken på kryostatobjektholderen. Juster bladholderen slik at bladvinkelen er tre til fem grader i forhold til prøven.Samle 10-mikrometer seksjoner på belagte mikroskop lysbilder. La seksjonene stå ved romtemperatur til de er helt tørre, og oppbevar dem deretter på minus 80 grader Celsius. Til å begynne med fargingen, ta ut lysbilder fra minus 80 grader Celsius, og hold dem ved romtemperatur i en time for å lufttørke seksjonene.Skyll lysbildene på 0,1%PBST tre ganger i fem minutter hver for å vaske ut OCT og gjennomsyre seksjonene. Tilsett 200 mikroliter med blokkeringsløsning til hvert lysbilde, og inkuber ved romtemperatur i 30 minutter. Fjern deretter blokkeringsløsningen uten å skylle lysbildet.Tilsett 100 mikroliter primært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning til hvert lysbilde, og inkuber over natten ved fire grader Celsius. Skyll lysbildene med PBS tre ganger i 10 minutter hver ved romtemperatur. Tilsett 100 mikroliter sekundært antistoff fortynnet i blokkeringsløsning, og inkuber i en time ved romtemperatur, beskyttet mot lys.Skyll i PBS tre ganger i 10 minutter hver ved romtemperatur, fortsatt beskyttet mot lys. For å montere lysbildene, legg til to dråper anti-fade medium med DAPI på hvert lysbilde, dekk med en dekkslips, og lagre på fire grader Celsius til klar til bilde. Frontale bein av kontroll embryoer var positive for pSmad1/5/9, nedstrøms BMP signalfaktorer, og Ki67, en celle spredning markør.I nevrale crest-spesifikke, konstituerende aktiverte BMPR1A muterte embryoer ble imidlertid pSmad1/5/9-nivåene økt mens Ki67-nivåene ble redusert. Videre ble det observert flere apoptotiske celler i frontale bein av muterte embryoer enn de av kontrollembryoer. Koronale kryoseksjoner av gelatin-innebygde hoder viser tydelig GFP-signal og RFP-signal fra en tdTomato-kassett i nesebenet og nesevevet, noe som viser at gelatin ikke forstyrrer fluorescerende signaler.Når disse seksjonene ble immunostained for SOX9 eller Osterix og E11 /Podoplanin, ble seksjoner av god kvalitet hentet fra de fleste av de tre ukers harde vevene. På den annen side, med tre måneder gamle prøver, ble seksjoner av god kvalitet bare oppnådd i noen av de harde vevene, inkludert de trabecular rommene i lårbenet, nesevevet og skallen, inkludert nese-premaxilla sutur og omkringliggende bein i hodet. SOX9-positive celler ble oppdaget spesielt i kondrocytter av vekstplaten og leddet fra lårbenet og neseseptumet.I den tre uker gamle fortenn ble SOX9 oppdaget i mesenchymale celler. Osterix og E11 doble fargingsresultater viser at Osterix ble oppdaget i osteoblaster, mens E11 ble påvist i osteocytter av bein fra lårbenet og hodet. I den tre uker lange fortenn var Osterix positiv i odontoblaster, mens E11 var positiv i follikkel mesenchymale celler.Vennligst ikke overfiks prøver med 4%PFA. For snitting av udecalcified hardt vev i gelatin, er den beste temperaturen minus 25 grader Celsius og lavere. Etter denne prosedyren kan nivåer av fluorescens kvantifiseres som beskrevet i vår protokoll.Disse målingene vil gi informative data for å vise forskjellen på det relative nivået av protein mellom ulike grupper. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for dobbel eller trippel farging for å få co-uttrykksmønstre av forskjellige proteiner. 4% PFA er farlig.Det kan forårsake hudallergier, alvorlig øyeskade, organskader eller kreft. Bruk personlig verneutstyr, og vask huden grundig etter håndtering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automatisert Kvantifisering av Hematopoietiske Cell - stromal Cell Samhandling i Histologiske Bilder av Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation og organotypiske Slice Culture of Mouse hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generering Primær fibroblastkulturer fra Muse øre og hale Vev

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Identifisering av kritiske forhold for Farging i Pea Aphid Embryoet: Økende Tissue Permeabilitet og Avtagende bakgrunnsfarging

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Disseksjon og koronale del forberedelse for å utvikle musen hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Disseksjon, kultur og analyse av primær skallen neural Crest celler fra mus for studiet av Neural Crest Cell delaminering og migrasjon

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonal genetisk tracing bruke konfetti musen til å studere Mineralisert vev

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser Capture Microdissection av mus embryonale brusk og bein for Gene Expression analyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...