Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01DE020843 до Y.M.), Международной ассоциацией ФОП (Y.M.), а также грантом от Национального фонда естественных наук Китая (31500788 до J.Y.).

Все эксперименты с мышью проводились в соответствии с руководящими принципами Мичиганского университета, охватывающими гуманный уход и использование животных в исследованиях. Все процедуры для животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

Здесь мы предоставляем подробный протокол для подготовки головы мыши и недекальцифицированных костных тканей, а также криосекции для иммуносточки зрения клеточной пролиферации, клеточной смерти и сигнальных маркеров БМП. Мы также подробно описываем стратегию получения количественн...

Лицо является ключевой частью человеческой идентичности, и состоит из нескольких различных типов тканей, таких как эпителий, мышцы, кости, хрящи, зуб. Эти ткани являются производными от всех трех слоев зародыша: эктодерм, эндодерм, и мезодерм1,2. Для правильного узорства и развития черепно-мозговых тканей, пролиферации клеток, смерти и дифференциации должны быть высоко скоординированы и регулируются конкретными сигнальными путями, такими как Wnt, Fgf, Hh и Bmp пути3,4 ,5. Дефекты пролиферации, выживания или дифференциации клеток приведут к черепно-мозговым порокам развития, которые являются одними из наиболее часто встречающихся врожденных дефектов. Трансгенные мыши являются полезными инструментами дляизучения механизмов краниофациального морфогенеза и патогенеза1,2,3,4. Понимание изменений в черепно-мозговых структурах во время развития и патогенеза поможет прояснить ключевые принципы развития, а также механизмы черепно-мозговых пороковразвития1,2,3 ,4,5.
Окрашивание целых креплений или секционированных тканей с конкретными антителами является бесценным методом для определения пространственного распределения белков, представляющих интерес 6. Формально иммуностоидирование тканей может опираться либо на иммуногистохимию (IHC), либо на иммунофлуоресценцию (ИФ). По сравнению с непрозрачным продуктом реакции, генерируемым с хромогенным субстратом, таким как 3,3'-Диаминобензидин (DAB) IHC, IF включает в себя использование флуоресцентных конъюгатов, видимых флуоресценцией микроскопии. Таким образом, ЕСЛИ может четко дифференцировать положительные клетки от фонового шума, и позволяет изображения, которые будут количественно проанализированы и расширены в простой моды с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ и Adobe Photoshop7,8. Весь подход крепления окрашивания работает на небольших блоках ткани (толщиной менее 5 мм), которые могут предоставить трехмерную информацию о расположении белков/антигенов без необходимости реконструкции из разделов9,10 . Однако, по сравнению с секциями тканей, цельное иммуносирование монтирует много времени и требует больших объемов антител. Не все антитела совместимы с основным подходом всего крепления. Кроме того, неполное проникновение антител приведет к неравномерному окрашиванию или ложному отрицательному окрашиванию. Здесь мы сосредоточимся на иммунофлуоресценции обнаружения белков / антигенов на разделенных тканей. Для твердых тканей (например, головы, зуба, длинной кости), осаждение кальция во время развития / патогенез делает образец трудно сечения и легко промыть во время иммуно-денсивного лечения11,12. Большинство имеющихся в настоящее время протоколов декальцифифицировать твердые ткани перед встраиванием, чтобы сделать секционирование легче, что отнимает много времени и может уничтожить морфологию и антигены образцов, если обращаться неправильно11,12. Чтобы преодолеть проблемы, мы оптимизировали подход к криоотделению твердых тканей без декальцинации, что привело к улучшению визуализации их морфологии и распространению сигнальных белков.
Описанный здесь протокол используется для определения морфометрических и гистологических изменений в черепно-мозговых тканях трансгенных мышей БМП. В частности, протокол включает в себя (1) уборку и вскрытие тканей головы, (2) раздел и иммуностонинг экспериментальных маркеров (Ki67, pSmad1/5/9) наряду с окрашиванием TUNEL, (3) визуализацией секций с использованием флуоресцентного микроскопа и, наконец, (4) анализ и количественная оценка результатов. Протокол для подготовки и криосецификации твердых тканей без декальцинации также описано13. Эти методы оптимизированы для черепно-мозговых тканей. Они также применимы к другим тканям разного возраста образцов с соответствующими модификациями.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

Ткань иммуностоинга обеспечивает высокоспецифическое и надежное обнаружение белков, представляющих интерес в данной ткани. Здесь мы описываем полный и простой протокол для обнаружения экспрессии белка во время черепно-мозгового морфогенеза/ патогенеза с использованием мышичерепных тканей в качестве примеров. Протокол состоит из подготовки и криоотделения тканей, косвенной иммунофлуоресценции, приобретения изображения и количественной оценки. Кроме того, описан метод подготовки и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей для иммуностоинга, в качестве примеров используется черепно-мозговая ткани и длинные кости. Эти методы являются ключевыми для определения экспрессии белка и морфологических / анатомических изменений в различных тканях во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза. Они также применимы к другим тканям с соответствующими изменениями. Знание гистологии и высокое качество разделов имеют решающее значение для того, чтобы сделать научные выводы из экспериментальных результатов. Потенциальные ограничения этой методологии включают, но не ограничиваются спецификой антител и трудностями количественной оценки, которые также обсуждаются здесь.

Эмбриональные участки черепно-мозговой ткани После вышеуказанных шагов, головы были расчленены от управления(P0-Cre) или мутант (в обязательно активированный Bmpr1a в нервных клетках гребня, P0-Cre; caBmpr1a) зародышить на зародышевом дне (E) 16.5 или 18.5. После фик...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Ткань Подготовка и иммуностоирование мыши Craniofacial тканей и недекализированных костей

Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения и количественной оценки уровня белка во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза путем иммуносохранения с помощью мыши черепно-лицевой ткани в качестве примеров. Кроме того, мы описываем метод приготовления и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей у молодых мышей для иммунодефицита.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Здесь мы представляем наш простой протокол для обнаружения иммунофлуоресценции на белках на секционных материалах. Этот метод не требует поиска антигена. Мы будем использовать мышиные головки, в том числе неутященные твердые ткани.Основным преимуществом этого метода является пропуск поиска антигена и декалькации твердых тканей. Это приводит к хорошему качеству иммуностимуляторных результатов. Этот метод также экономит время и труд.Этот метод также применим к другим тканям с соответствующими модификациями. Чтобы сделать хорошие разделы из неутязвимых тканей, вскрыть ткани мишени дальше обрезать окружающие ткани, и при необходимости лечить образцы с 10%EDTA при четырех градусах по Цельсию в течение двух дней до криопротекции. Визуальная демонстрация дает подробное и четкое объяснение процедуры этого метода.Для начала приготовьте одну 10-сантиметровую и несколько 3,5-сантиметровых блюд, содержащих PBS, и одну культурную тарелку из 12 колодец, содержащую два миллилитров по 4%PFA в PBS в каждом колодеце для каждой беременной мыши, и поместите их все на лед. Чтобы вскрыть эмбрионы от беременных мышей, возьмите кожу ниже центра живота усыпленной мыши с мибрами, прорезать только кожу, а затем осторожно потяните на кожу, чтобы отделить ее от основной стенки мышц живота. Следуя той же линии разреза кожи, нарезать брюшную полость.Удалите матку, содержащую вереницу эмбрионов. Затем удалите эмбрионы, аккуратно отрезав стенку матки, которая уберет экстраэмбрионные ткани, такие как желточный мешок и амнион. Вырезать и изолировать голову от каждого эмбриона, и с типсами передачи каждой головы в отдельный колодец 12-хорошо пластины, содержащей 4%PFA.Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение четырех часов, чтобы исправить. Промыть головы в PBS при четырех градусах по Цельсию с нежной тряской в течение 12 часов. Чтобы криопротезть головы, перенесите их с помощью типсов в новую пластину из 12 колодец, содержащую два миллилитров 30%-ую сахарозу в PBS.Инкубировать с нежным возбуждением при четырех градусах по Цельсию, пока головы опускаются на дно блюда. Чтобы встроить криопротекторные головки, перенесите их в форму, содержащую оптимальное температурное соединение резки, и эквилибрат в течение нескольких минут. Используя типсы, отрегулируйте расположение и направление образцов так, чтобы обрезанная сторона образцов была расположена в нижней части встраиваемой формы.Затем поместите плесень на сухой лед, чтобы заморозить, и хранить в полиэтиленовом пакете при температуре минус 80 градусов по Цельсию до готовности к криозиции. Для послеродовой ткани, после удаления кожи и жировой ткани усыпляемой, трехнедельной до трехмесячной мыши, вырезать и изолировать голову и удалить челюсти. Затем, исправить и криопротекторной головы, как это делается с эмбрионом головы.Вставлять в 8%gelatin таким же образом, как эмбрион головы в OCT, и держать Cryomolds в полиэтиленовый пакет при температуре минус 80 градусов по Цельсию до криозирования. Установите соответствующую температуру криостата. Поместите образцы в криостатической камере в течение примерно 30 минут, чтобы уравночные до криостата температуры.Удалите блок с образцом из Cryomold, и смонтировать его с OCT падение на образец патрон и заморозить его, убедившись, что держать подстриженной стороне образца дальше от патрона и перед оператором. Загрузите блок-монтажный патрон на держателя объекта криостата. Отрегулируйте держатель лезвия так, чтобы угол лезвия был от трех до пяти градусов по отношению к образцу.Соберите 10-микрометровые секции на покрытые микроскопом слайды. Оставьте секции при комнатной температуре до полного высыхания, а затем храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Для начала окрашивание вынул горки от минус 80 градусов по Цельсию, и держать их при комнатной температуре в течение одного часа, чтобы высушить секции.Промыть слайды в 0,1%PBST три раза в течение пяти минут каждый, чтобы вымыть OCT и пронизать разделы. Добавьте 200 микролитров блокирующего раствора к каждому слайду и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем удалите блокирующий раствор, не полоская слайд.Добавьте 100 микролитров первичных антител, разбавленных в блокирующий раствор для каждого слайда, и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. Промыть горки с PBS три раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре. Добавьте 100 микролитров вторичных антител, разбавленных блокирующим раствором, и инкубировать в течение одного часа при комнатной температуре, защищенной от света.Промыть в PBS три раза в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, по-прежнему защищены от света. Чтобы смонтировать слайды, добавьте две капли антиутухой среды с DAPI на каждом слайде, накройте крышкой и храните при четырех градусах Цельсия до готовности к изображению. Фронтальные кости контрольных эмбрионов были положительными для pSmad1/5/9, ниже по течению BMP сигнальных факторов, и Ki67, маркер пролиферации клеток.Однако в нейронных эмбрионах-мутантах, активированных в составе BMPR1A, уровни pSmad1/5/9 были увеличены, в то время как уровни Ki67 были снижены. Кроме того, в лобных костях эмбрионов мутантов наблюдалось больше апоптотических клеток, чем у контрольных эмбрионов. Корональные криозы головки, встроенные в желатин, ясно показывают сигнал GFP и сигнал RFP из кассеты tdTomato в носовой кости и носовых тканях, демонстрируя, что желатин не мешает флуоресцентным сигналам.Когда эти разделы были иммунотеминированы для SOX9 или Osterix и E11/Podoplanin, качественные секции были получены из большинства трехнедельных твердых тканей. С другой стороны, с трехмесячных образцов, хорошего качества разделы были получены только в некоторых из твердых тканей, в том числе трабекулярных отсеков бедренной кости, носовых тканей и черепа, в том числе носовой премаксилла шва и окружающих костей головы. SOX9-положительные клетки были обнаружены именно в хондроцитах пластины роста и суставах из бедренной кости и носовой перегородки.В трехнедельном резцаторе SOX9 был обнаружен в мезенхимальных клетках. Остерикс и E11 двойное окрашивание результаты показывают, что Osterix был обнаружен в остеобласты, в то время как E11 был обнаружен в остеоцитов костей из бедренной кости и головы. В трехнедельном резцаторе, Osterix был положительным в odontoblasts, в то время как E11 был положительным в фолликула мезенхимальных клеток.Пожалуйста, не переиммите образцы с 4%PFA. Для сеяния неутященных твердых тканей в желатине лучшая температура составляет минус 25 градусов по Цельсию и ниже. После этой процедуры уровни флуоресценции могут быть количественно определены, как описано в нашем протоколе.Эти измерения будут предоставлять информативные данные, чтобы показать разницу относительного уровня белка между различными группами. После его развития, этот метод проложил путь для двойного или тройного окрашивания, чтобы получить совместное выражение моделей различных белков. 4%PFA является опасным.Это может вызвать аллергию на кожу, серьезные повреждения глаз, повреждения органов, или рак. Пожалуйста, используйте средства индивидуальной защиты, и мыть кожу тщательно после обработки.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Автоматизированная Количественное кроветворной клетки - Стромальные межклеточного взаимодействия в гистологических Изображения Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Создание первичного фибробластов Культуры с уха мыши и хвост тканей

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Идентификация критических условий для Иммуноокрашивание в гороховой тли эмбрионов: Повышение проницаемости тканей и уменьшения фонового окрашивания

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Биоинжиниринг гуманизированных микроуровней костного мозга в мышах и их визуализация с помощью Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Живая визуализация мышей

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Вскрытие и подготовка корональных срез развития гипофиза мыши

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Рассечение, культура и анализ первичных черепных нейронных клеток от мыши для изучения нейронных клеток Креста Delamination и миграции

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Клональная генетическая трассировка с помощью мыши Confetti для изучения минерализованных тканей

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Лазерная захват микродиссекции мыши эмбрионального хряща и кости для анализа экспрессии генов

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...