Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (R01DE020843 till Y.M.), International FOP Association (Y.M.), och en bidrag-in-Aid från National Natural Science Foundation i Kina (31500788 till J.Y.).

Alla mus experiment utfördes i enlighet med University of Michigan riktlinjer som omfattar Human Care och användning av djur i forskning. Alla djurförsök som används i denna studie godkändes av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) vid University of Michigan (protokoll #PRO00007715).
1. vävnads beredning
<ol><li>
Beredning av embryonala vävnader
	<ol>
<li>Förbered 1 10 cm skålen och flera 3,5 cm rätter som innehåller fosfatbuffrad salt...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

Här ger vi ett detaljerat protokoll för beredning av mus huvudet och undecalcified ben vävnader, och kryosektionering för immunofärgning av cellproliferation, celldöd, och BMP signal markörer. Vi specificerar också strategin för att erhålla kvantitativa data från Immunofluorescerande bilder. Dessa metoder kan också tillämpas på andra vävnader med lämpliga modifieringar.
Villkoren för vävnads beredning varierar beroende på vävnadernas storlek och typ. Fixeringen och kryoskyd...

Ansiktet är en viktig del av människans identitet, och består av flera olika typer av vävnader, såsom epitel, muskler, ben, brosk, tand. Dessa vävnader härstammar från alla tre bakterie lagren: ektoderm, endoderm och mesoderm1,2. För korrekt mönkning och utveckling av kraniofaciala vävnader, cellproliferation, död och differentiering måste vara mycket samordnade och regleras av specifika signalering vägar, såsom WNT, FGF, hh och BMP vägar3,4 ,5. Defekter i proliferation, överlevnad eller differentiering av celler kommer att leda till kraniofaciala missbildningar, som är bland de vanligast förekommande medfödda missbildningar. Transgena möss är användbara verktyg för att studera mekanismerna för kraniofacial morfogenes och patogenes1,2,3,4,5. Att förstå förändringarna i kraniofaciala strukturer under utveckling och patogenes kommer att bidra till att klargöra viktiga utvecklingsprinciper samt mekanismerna för kraniofaciala missbildningar1,2,3 ,4,5.
Färgning av hela Mount eller sektionerade vävnader med specifika antikroppar är en ovärderlig teknik för bestämning av rumslig distribution av proteiner av intresse 6. Formellt kan vävnads immunofärgning förlita sig antingen på immunohistokemi (IHC) eller immunofluorescens (IF). Jämfört med den ogenomskinliga reaktionsprodukt som genereras med ett kromogent substrat såsom 3, 3 '-Diaminobenzidin (DAB) av IHC, om det innebär användning av fluorescerande konjugat synligt genom fluorescens mikroskopi. Därför, om kan tydligt skilja positiva celler från bakgrundsbrus, och gör att bilder kan kvantitativt analyseras och förbättras på ett enkelt sätt av program som imagej och Adobe Photoshop7,8. Hela monteringen färgning tillvägagångssätt fungerar på små block av vävnad (mindre än 5 mm tjock), som kan ge tredimensionell information om placeringen av proteiner/antigener utan behov av rekonstruktion från avsnitt9,10 . Jämfört med vävnads sektioner är dock hela Mount immunofärgning tidskrävande och kräver stora mängder antikropps lösningar. Alla antikroppar är inte kompatibla med det grundläggande hela monterings sättet. Dessutom kommer den ofullständiga penetrationen av antikroppar resultera i ojämn färgning eller falsk negativ färgning. Här kommer vi att fokusera på immunofluorescensen detektion av proteiner/antigener på sektionerade vävnader. För hårda vävnader (t. ex, huvud, tand, långa ben), kalcium deposition under utveckling/patogenes gör provet svårt att avsnitt och lätt sköljas av under immunofärgning behandling11,12. De flesta av de för närvarande tillgängliga protokollen avkalka hårda vävnader innan inbäddning för att göra snittning lättare, vilket är tidskrävande och kan förstöra morfologi och antigener av prover om de hanteras felaktigt11,12. För att övervinna problemen, vi optimerat ett tillvägagångssätt för kryosektionering av hårda vävnader utan avalskning, vilket leder till förbättrad visualisering av deras morfologi och distribution av signalering proteiner.
Det protokoll som beskrivs här används för att bestämma morphometriska och histologiska förändringar i kraniofaciala vävnader av BMP transgena möss. Specifikt innehåller protokollet (1) skörd och dissekera huvud vävnader, (2) avsnitt och immunofärgning av experimentella markörer (Ki67, pSmad1/5/9) tillsammans med TUNEL färgning, (3) Imaging sektionerna med fluorescensmikroskop, och slutligen (4) analysera och kvantifiera resultaten. Protokollet för beredning och kryosektion av hårda vävnader utan avalskning beskrivs också13. Dessa metoder är optimerade för kraniofacial vävnader. De är också tillämpliga på andra vävnader från olika åldrar av prover med lämpliga modifieringar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

Vävnads immunofärgning ger mycket specifik och tillförlitlig detektion av proteiner av intresse inom en given vävnad. Här beskriver vi ett komplett och enkelt protokoll för att detektera proteinuttryck under kraniofacial morfogenes/patogenes med hjälp av mus kraniofacial vävnader som exempel. Protokollet består av beredning och kryosektionering av vävnader, indirekt immunofluorescens, bild förvärv och kvantifiering. Dessutom beskrivs en metod för beredning och kryosektionering av undecalcified hård vävnad för immunofärgning, med hjälp av kraniofaciala vävnader och långa ben som exempel. Dessa metoder är avgörande för att bestämma proteinuttryck och morfologiska/anatomiska förändringar i olika vävnader under kraniofacial morfogenes/patogenes. De är också tillämpliga på andra vävnader med lämpliga modifieringar. Kunskap om histologi och hög kvalitet på sektioner är avgörande för att dra vetenskapliga slutsatser från experimentella resultat. Potentiella begränsningar av denna metod inkluderar men är inte begränsade till specificitet av antikroppar och kvantifieringsproblem, som också diskuteras här.

Embryonala kraniofaciala vävnad sektioner Efter ovanstående steg var huvuden dissekeras från kontroll (P0-CRE) eller mutant (konstitutivt aktiveras Bmpr1a i neurala Crest celler, P0-CRE; caBmpr1a) embryon på embryots dag (E) 16,5 eller 18,5. Efter fixering i 4% PFA för 4 h, prover var inbäddade i oktober och kryosektionerade Coralt. Resulterade avsnitt var immunostained med antikroppar mot pSmad1/5/9 (nedströms BMP signalering faktorer) eller K...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Vävnads beredning och immunofärgning av mus kraniofaciala vävnader och Undecalcified Bone

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att upptäcka och kvantifiera proteinnivåer under kraniofacial morfogenes/patogenes genom immunofärgning med hjälp av mus kraniofacial vävnader som exempel. Dessutom beskriver vi en metod för beredning och kryosektionering av undecalcified hårda vävnader från unga möss för immunofärgning.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Här presenterar vi vårt enkla protokoll för immunofluorescens detektion på proteiner på sektionerade material. Denna metod kräver inte antigenhämtning. Vi kommer att använda mushuvuden, inklusive okalkade hårda vävnader.Den största fördelen med denna teknik är att hoppa över antigenhämtning och dekalcifiering av hårda vävnader. De leder till en god kvalitet på immunfärgning resultat. Denna metod sparar också både tid och arbete.Denna metod är även tillämplig på andra vävnader med lämpliga ändringar. För att göra fina sektioner från okalkade vävnader, dissekera din målvävnad ytterligare för att trimma omgivande vävnader, och vid behov behandla proverna med 10%EDTA vid fyra grader Celsius i två dagar före kryoskydd. Visuell demonstration ger en detaljerad och en tydlig förklaring av proceduren för denna metod.Till att börja med förbereda en 10-centimeter och flera 3,5-centimeters rätter som innehåller PBS och en 12-brunns odlingsplatta som innehåller två milliliter på 4%PFA i PBS i varje brunn för varje gravid mus, och placera dem alla på is. För att dissekera embryon från dräktiga möss, ta tag i huden under mitten av magen på en avlivad mus med tlyckor, skär genom huden bara, och sedan försiktigt dra på huden för att separera den från den underliggande bukmuskelväggen. Efter samma linje av huden snitt, skär in i bukhålan.Ta bort livmodern som innehåller en sträng av embryon. Sedan tar du bort embryona genom att försiktigt skära bort livmoderväggen, som kommer att ta bort de extraembryoniska vävnaderna som gulesäcken och amnionen. Skär och isolera huvudet från varje embryo, och med tuts överföra varje huvud i en separat brunn av en 12-brunnsplatta som innehåller 4%PFA.Inkubera vid fyra grader Celsius i fyra timmar för att fixa. Skölj huvudena i PBS i fyra grader Celsius med varsam skakning i 12 timmar. För att cryoprote huvudena, överföra dem med hjälp av tärna till en ny 12-brunnsplatta som innehåller två milliliter på 30%sackaros i PBS.Inkubera med mild agitation vid fyra grader Celsius tills huvuden sjunker till botten av skålen. För att bädda in kryoskyddade huvuden, överföra dem till en form som innehåller Optimal Cutting Temperature Compound, och jämvikt i flera minuter. Med hjälp av triktor, justera placeringen och riktningen av proverna så att den trimmade sidan av proverna är vänd mot botten av inbäddningsformen.Sedan, placera formen på torris att frysa, och förvara i en plastpåse på minus 80 grader Celsius tills redo för kryosektionering. För postnatal vävnad, efter att ha tagit bort huden och fettvävnader av en avlivas, tre veckor till tre månader gammal mus, klippa och isolera huvudet och ta bort underdibel. Sedan, fixa och cryoprotect huvudet som gjort med embryo huvuden.Bädda in i 8%gelatin på ett liknande sätt som embryohuvuden i OCT, och förvara Cryomolds i en plastpåse på minus 80 grader Celsius tills cryosectioning. Ställ in lämplig kryostattemperatur. Placera proverna i kryostatkammaren i ca 30 minuter för att ekvilorera till kryostattemperaturen.Ta bort blocket med provet från Cryomold, och montera den med en OCT droppe på provet chuck och frysa den, se till att hålla den trimmade sidan av provet längst bort från chucken och vänd mot operatören. Fyll på den blockmonterade chucken på hållare för kryostatobjekt. Justera bladhållaren så att bladvinkeln blir tre till fem grader i förhållande till provet.Samla 10-mikrometersektioner på belagda mikroskopglas. Lämna sektionerna i rumstemperatur tills den är helt torr, och förvara dem sedan i minus 80 grader Celsius. Till att börja med färgningen, ta ut diabilder från minus 80 grader Celsius, och hålla dem i rumstemperatur i en timme för att lufttorka sektionerna.Skölj av objektglasen i 0,1 %PBST tre gånger i fem minuter vardera för att tvätta bort OCT och permeabilisera sektionerna. Tillsätt 200 mikroliter av blockerande lösning till varje objektglas, och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter. Ta sedan bort blockeringslösningen utan att skölja objektglaset.Tillsätt 100 mikroliter av primär antikropp utspädd i blockerande lösning till varje objektglas, och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Skölj objektglasen med PBS tre gånger i 10 minuter vardera i rumstemperatur. Tillsätt 100 mikroliter sekundär antikropp utspädd i blockerande lösning, och inkubera i en timme vid rumstemperatur, skyddade från ljus.Skölj i PBS tre gånger i 10 minuter vardera vid rumstemperatur, fortfarande skyddad från ljus. För att montera bilderna, lägga till två droppar av anti-fade medium med DAPI på varje bild, täcka med en coverslip, och lagra på fyra grader Celsius tills redo att bilden. Frontal ben av kontroll embryon var positiva för pSmad1/5/9, nedströms BMP signalering faktorer, och Ki67, en cell spridning markör.I neurala crest-specifika, kontituivt aktiveras BMPR1A mutanta embryon, dock, pSmad1/5/9 nivåer var ökade medan Ki67 nivåer minskades. Vidare observerades fler apoptotiska celler i frontalbenen hos muterade embryon än de som finns hos kontrollembryon. Koronal cryosections av gelatin-inbäddade huvuden visar tydligt GFP signal och RFP signal från en tdTomato kassett i näsbenet och näsvävnader, visar att gelatin inte stör fluorescerande signaler.När dessa avsnitt var immunostained för SOX9 eller Osterix och E11/Podoplanin, god kvalitet avsnitt erhölls från de flesta av de tre veckor hårda vävnader. Å andra sidan, med tre månader gamla prover, god kvalitet avsnitt erhölls endast i några av de hårda vävnader, inklusive trabecular fack lårbenet, nasala vävnader och skallen, inklusive nasal-premaxilla sutur och omgivande ben av huvudet. SOX9-positiva celler upptäcktes specifikt i chondrocytes av tillväxt plattan och den gemensamma från lårbenet och nässkiljeväggen.I den tre veckor gamla framtåren upptäcktes SOX9 i de mesenkymala cellerna. Osterix och E11 dubbel färgning resultat visar att Osterix upptäcktes i osteoblaster, medan E11 upptäcktes i osteocytes av ben från lårbenet och huvudet. I den tre veckor framtå, Osterix var positiv i odontoblasts, medan E11 var positiv i follicle mesenchymal celler.Vänligen överfixar inte prover med 4%PFA. För snittning av odekalkerade hårda vävnader i gelatin är bästa temperaturen minus 25 grader Celsius och lägre. Efter detta förfarande kan nivåerna av fluorescens kvantifieras enligt beskrivningen i vårt protokoll.Dessa mätningar kommer att ge informativa data för att visa skillnaden i den relativa nivån av protein mellan olika grupper. Efter dess utveckling, banade denna teknik vägen för dubbel eller trippel färgning för att få co-uttryck mönster av olika proteiner. 4%PFA är farligt.Det kan orsaka hudallergier, allvarliga ögonskador, organskador, eller cancer. Använd gärna personlig skyddsutrustning, och tvätta huden noga efter hantering.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automatiserad Kvantifiering av hematopoetisk cell - stromacells- Interaktioner i Histologiska bilder från Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporation och Organotypic Slice Kultur av Mouse hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Generera Primär fibroblastkulturer från mus Öron och Tail Vävnader

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Identifiering av kritiska förhållanden för immunfärgning i Pea Aphid embryon: Öka Tissue Permeabilitet och Minska bakgrundsfärgning

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserade benmärgsmiljöer i mus och deras visualisering genom Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Dissektion och koronalt Slice förberedelse att utveckla mus hypofysen

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Dissektion, kultur och analys av primära kraniella neurala krön celler från musen för studiet av neurala Crest cell delaminering och migration

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Klonala genetiska spårning använda Confetti musen för att studera mineraliserade vävnader

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laserinfångning mikrodissektion av mus embryonala brosk och ben för gen uttrycks analys

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...