Name: tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01DE020843 Y.M.), uluslararası FOP Derneği (Y.M.) ve Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31500788 J.Y.) bir Grant-in-Aid tarafından desteklenmektedir.

Tüm fare deneyler, araştırma hayvanların insani bakım ve kullanımı kapsayan Michigan Üniversitesi kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan prosedürleri, Michigan Üniversitesi 'nde (protokol #PRO00007715) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıesuc) tarafından onaylanmıştır.
1. doku hazırlama
<ol><li>
Embriyonik dokuların hazırlanması
	<ol>
<li>Hazırlamak 1 10 cm çanak ve fosfat tamponlu tuz (PBS...

<ol>
	<li>Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development:+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning.">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li><li>Marcucio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facial+morphogenesis:+physical+and+molecular+interactions+between+the+brain+and+the+face.">Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).</li><li>Graf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+mechanisms+in+development+and+disease:+BMP+signaling+in+craniofacial+development.">Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).</li><li>Snider, T. N., Mishina, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cell+contribution+to+craniofacial+formation,+pathology,+and+future+directions+in+tissue+engineering.">Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering.</a> Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).</li><li>Mishina, Y., Snider, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+cell+signaling+pathways+critical+to+cranial+bone+development+and+pathology.">Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology.</a> Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).</li><li>Van Hecke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routine+Immunohistochemical+Staining+Today:+Choices+to+Make,+Challenges+to+Take.">Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take.</a> Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).</li><li>Xiao, C., Dan-Bi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+staining+immunohistochemistry.">Double staining immunohistochemistry.</a> North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).</li><li>Zongli, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence+and+immunohistochemical+staining+with+anti-insulin+antibodies+on+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+pancreatic+tissue+microarray+sections.">Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).</li><li>Dun, X. P., Parkinson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+immunostaining+on+mouse+sciatic+nerves+to+visualize+events+of+peripheral+nerve+regeneration.">Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration.</a> Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).</li><li>Akkiraju, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Immunostaining+and+Imaging+Methodology+to+Determine+Cell+and+Protein+Distributions+within+the+Bone+Environment.">An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).</li><li>Gonz&#225;lez-Ch&#225;vez, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+different+decalcifying+protocols+on+Osteopontin+and+Osteocalcin+immunostaining+in+whole+bone+specimens+of+arthritis+rat+model+by+confocal+immunofluorescence.">Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).</li><li>Kapelsohn, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Methods+for+Cutting,+Mounting,+and+Staining+Tissue+for+Neural+Histology.">Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology.</a> Protocol Exchange. , (2015).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).</li><li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+techniques:+current+perspectives.">Antigen retrieval techniques: current perspectives.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).</li><li>Adell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+on+paraffin-embedded+planarian+tissue+sections.">Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).</li><li>Griffioen, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin+embedding+to+preserve+lesion-damaged+hypothalami+and+intracerebroventricular+grafts+for+vibratome+slicing+and+immunocytochemistry.">Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry.</a> Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).</li><li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+demonstration+of+Fluoro-Turquoise+conjugated+gelatin+for+visualizing+brain+vasculature+and+endothelial+cells+and+their+characterization+in+normal+and+kainic+acid+exposed+animals.">In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).</li><li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat&#8208;embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat&#8208;embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li></ol>

Burada fare kafası ve undecalcified kemik dokularının hazırlanması için ayrıntılı bir protokol ve hücre proliferasyonu, hücre ölümü ve BMP sinyalizasyon işaretçileri immünostasyon için donuk kesit sağlar. Ayrıca immünofluorescent görüntülerden nicel veriler elde etme stratejisini de ayrıntılarıyla biliyoruz. Bu yöntemler, uygun değişikliklerle diğer dokulara da uygulanabilir.
Doku hazırlama koşulları dokuların boyutuna ve tipine göre farklılık gösterir. S...

Yüz insan kimliğinin önemli bir parçasıdır ve epitelyum, kas, kemik, kıkırdak, diş gibi çeşitli farklı dokulardan oluşur. Bu dokular üç germ katmanından türetilmiştir: ectoderm, endoderm, ve mezoderm1,2. Kraniyofasin dokularının uygun desenleme ve gelişimi için, hücre proliferasyonu, ölüm ve farklılaşma WNT, fgf, hh ve BMP yollar3,4 gibi belirli sinyal yolları tarafından son derece koordine ve düzenlenmiş olması gerekir ,5. Proliferasyon, hayatta kalma veya hücrelerin farklılaşma kusurları, en sık görülen konjenital Doğum kusurları arasında bulunan kraniyofasiyal malformasyonlara yol açacaktır. Transjenik fareler kraniyofasiyal morfogenez ve patogenezi1,2,3,4,5mekanizmaları çalışma için yararlı araçlardır. Geliştirme ve patogenezi sırasında kraniyofasiyal yapılardaki değişikliklerin anlaşılması, anahtar gelişimsel prensiplerin yanı sıra kraniyofasiyal malformasyonların mekanizmalarının açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olacaktır1,2,3 ,4,5.
Tüm montaj veya özel antikorlar ile kesitli dokuların boyama ilgi proteinlerinin uzamsal dağılımı belirlemek için paha biçilmez bir tekniktir 6. Resmi olarak, doku immünostans immunhistokimya veya immünofluorescence (IF) üzerine güvenebilir. IFC tarafından 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) gibi bir kromojenik substrat ile oluşturulan opak reaksiyon ürünü ile karşılaştırıldığında, floresan Konjugat floresans mikroskobu ile görülebilir kullanımını içerir. Bu nedenle, Eğer net bir şekilde arka plan gürültüsünden pozitif hücreleri ayırt edebilir ve görüntüler nicekatif olarak analiz ve ımagej ve Adobe Photoshop7,8gibi yazılım tarafından basit bir moda geliştirilmiş sağlar. Tüm Mount boyama yaklaşımı doku küçük bloklar üzerinde çalışır (daha az 5 mm kalınlığında), hangi bölümlerden yeniden yapılanma için gerek kalmadan proteinlerin/antijenler konumu hakkında üç boyutlu bilgi sağlayabilir9,10 . Ancak, doku bölümleri ile karşılaştırıldığında, tüm immünostüajlı montaj zaman alıcı ve antikor çözeltileri büyük hacimli gerektirir. Tüm antikorlar temel tüm montaj yaklaşımı ile uyumludur. Buna ek olarak, antikorların tamamlanmamış penetrasyonunu düzensiz boya veya yanlış negatif boyama neden olur. Burada, kesitli dokularda proteinler/antijenlerin immünofluoresesans tespiti üzerine odaklanacağız. Sert dokularda (örn. baş, diş, uzun kemik), gelişim sırasında kalsiyum birikimi/patogenezi numunenin bölüm için zor hale getirir ve immünostam tedavisi sırasında kolayca durulanır11,12. Şu anda mevcut protokoller çoğu zaman tüketen ve yanlış işlenmiş ise numunelerin Morfoloji ve antijenleri yok edebilir, kesit daha kolay yapmak için katıştırma önce sert dokulara kireçsizleştirir11,12. Sorunları aşmak için, biz kireç çözücü olmadan sert dokuların donuk kesit için bir yaklaşım optimize, onların Morfoloji ve sinyal proteinlerinin dağılımı geliştirilmiş görselleştirme yol.
Burada açıklanan protokol, BMP transjenik fareler kraniyofacial dokularda morfometrik ve histolojik değişiklikler belirlemek için kullanılmaktadır. Özellikle, protokol (1) hasat ve diseksiyon kafa dokularında, (2) bölümü ve deneysel işaretçileri (Ki67, pSmad1/5/9) ile birlikte TUNEL boyama, (3), floresan mikroskop kullanarak bölümler görüntüleme ve son olarak (4) immünosterleme içerir sonuçları analiz etmek ve ölçmek. Hazırlama ve çürütme olmadan sert dokular kriyosection için protokol de13açıklanmıştır. Bu yöntemler kraniyofasiyal dokular için optimize edilmiştir. Onlar da uygun modifikasyonlar ile numunelerin çeşitli yaştan diğer dokular için geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:752px;" width="752">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">#39475214</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">A-11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Antifade Mountant with DAPI</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Coverslips</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-545-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Cryostat</td>
			<td style="width:171px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Fluorescence microscope</td>
			<td style="width:171px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Gelatin</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">In Situ&#160;Cell Death Detection Kit</td>
			<td style="width:171px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">S7165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Brand</td>
			<td style="width:119px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">OCT Compound</td>
			<td style="width:171px;">Fisher Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">23-730-571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P6148&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Polyethylene glycol&#160;tert-octylphenyl ether</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T9284</td>
			<td style="width:167px;">Triton X-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Proteinase K</td>
			<td style="width:171px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">AM2542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9129</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2687446</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:296px;">Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody</td>
			<td style="width:171px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">13820</td>
			<td>Lot#:3; RRID:AB_2493181</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sodium citrate</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1613859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Sucrose</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Tris</td>
			<td style="width:171px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue preparation and immunostaining of mouse craniofacial tissues and undecalcified bone

Doku immünostası, belirli bir doku içinde ilgi proteinlerinin son derece spesifik ve güvenilir tespiti sağlar. Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında fare kraniyofasin dokularında örnek olarak protein ifadesini algılamak için tam ve basit bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, dokuların preparasyon ve kriyobölümlenmesini, dolaylı immünofluoresesans, görüntü edinme ve miktarlama içerir. Buna ek olarak, immünostasyon için undecalcified Sert dokularda hazırlık ve donuk kesit için bir yöntem tarif edilir, örnek olarak kraniyofasiyal dokular ve uzun kemikler kullanılarak. Bu yöntemler, kraniyofacial morfogenik/patogenezi sırasında çeşitli dokularda protein ifadesi ve morfolojik/anatomik değişikliklerin belirlenmesi için anahtardır. Onlar da uygun modifikasyonlar ile diğer dokular için geçerlidir. Histolojinin bilgi ve yüksek kalite bölümleri deneysel sonuçlardan bilimsel sonuçlar çekmek için önemlidir. Bu metodolojinin potansiyel sınırlamaları şunlardır ancak antikorların özgüllüğü ve burada da tartışılan ölçüme karşı zorluklar ile sınırlı değildir.

Embriyonik kraniyofasiyal doku bölümleri Yukarıdaki adımları takiben, kafaları kontrol (P0-CRE) veya Mutant (seçimli aktif Bmpr1a nöral Crest hücrelerinde, P0-CRE; caBmpr1a) embriyonik günde (E) 16,5 veya 18,5 embriyolar disseke edildi. 4 h için 4% PFA sabitleme sonra, numuneler OCT gömülü ve Cor, cryosec,. Sonuçlanan bölümler pSmad1/5/9 (alt BMP sinyal faktörleri) veya Ki67 (bir hücre proliferasyonu işaretçisi) karşı antikorlar...

Watch this Scientific Journal Video about Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone at JoVE.com

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında protein düzeylerini algılamak ve ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz Buna ek olarak, immünostasyon için genç farelerden undecalcified Sert dokularda hazırlama ve donuk kesit için bir yöntem açıklanmaktadır.

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Burada, kesitli malzemelerdeki proteinler üzerinde immünoresans tespiti için basit protokolümüzü sıyoruz. Bu yöntem antijen alma gerektirmez. Fare kafaları kullanacağız, dekalsif edilmemiş sert dokular da dahil.Bu tekniğin en büyük avantajı sert dokuların antijen alımı ve kireçlenme sini atlamaktır. Bunlar iyi bir immünboyama sonuçları nın kalitesine yol açar. Bu yöntem aynı zamanda hem zaman hem de emek tasarrufu sağlar.Bu yöntem, uygun modifikasyonları olan diğer dokular için de geçerlidir. Dekalsified dokulardan güzel bölümler yapmak için, daha fazla çevreleyen dokuları kırpma küçülme hedef doku incelemek ve gerekirse kriyokoruma önce iki gün boyunca dört derece santigrat% 10 EDTA ile örnekleri tedavi. Görsel gösteri, bu yöntemin prosedürünün ayrıntılı ve net bir açıklamasını sağlar.Başlamak için, her hamile fare için her kuyuda PBS'de %4 PFA'dan oluşan 10 santimetrelik ve PBS içeren birkaç adet 3,5 santimetrelik tabak hazırlayın ve hepsini buza koyun. Hamile farelerden embriyoları incelemek için, forceps ile ötenazi bir farenin göbek merkezinin altındaki deri kapmak, sadece deri ile kesilmiş, ve sonra yavaşça altta yatan karın kas duvarından ayırmak için deri çekin. Deri kesi aynı satırı takip, karın boşluğu içine kesilmiş.Bir dizi embriyo içeren rahmi çıkarın. Sonra, yavaşça yumurta kesesi ve amnion gibi ekstraembriyonik dokuları kaldıracaktır rahim duvarı, keserek embriyoları çıkarın. Her embriyodan başı kesin ve izole edin ve forcep'ler ile her kafa %4 PFA içeren 12 kuyulu bir plakanın ayrı bir kuyusuna aktarın.Dört saat boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yat. PBS'deki kafaları dört santigrat derecede 12 saat boyunca hafifçe sallayarak durula. Kafaları kriyokorumak için, pbs%30 sakaroz iki mililitre içeren yeni bir 12-well plaka içine forceps kullanarak aktarın.Başları çanak altına batana kadar dört derece santigrat nazik ajitasyon ile kuluçka. Kriyokorunmuş kafaları yerleştirmek için, bunları Optimal Kesme Sıcaklık Bileşiği içeren bir kalıba aktarın ve birkaç dakika boyunca dengeleyin. Forceps kullanarak, numunelerin yerini ve yönünü, numunelerin kesilmiş tarafının gömme kalıbının altına dönük olacak şekilde ayarlayın.Daha sonra, donmak için kuru buz üzerine kalıp yerleştirin ve kriyosectioning için hazır olana kadar eksi 80 santigrat derece bir plastik torbada saklayın. Doğum sonrası doku için, bir ötenazi deri ve yağ dokuları çıkardıktan sonra, üç hafta üç aylık fare, kesilmiş ve baş izole ve mandibula kaldırmak. Sonra, düzeltmek ve embriyo kafaları ile yapılan baş kriyoprotect.EKIM embriyo başkanları gibi benzer bir şekilde% 8 jelatin gömmek ve kriyosectioning kadar eksi 80 santigrat derece bir plastik torbada Cryomolds tutun. Uygun kriyostat sıcaklığını ayarlayın. Kriyostat sıcaklığına denk gelmek için numuneleri yaklaşık 30 dakika kriyostat odasına yerleştirin.Cryomold'dan numuneyle birlikte bloğu çıkarın ve numunenin kesilmiş tarafını chuck'tan en uzakta ve operatöre bakacak şekilde tutup, numunenin kesilmiş tarafını tutmak için bir OCT damlası ile numunenin üzerine monte edin ve dondurun. Bloyostat nesne tutucuüzerine blok monte chuck yükleyin. Bıçak tutucuyu, bıçak açısının örneğe göre 3-5 derece olacak şekilde ayarlayın.Kaplamalı mikroskop slaytlar üzerine 10 mikrometre bölümleri toplayın. Bölümleri tamamen kuruyana kadar oda sıcaklığında bırakın ve eksi 80 derecede saklayın. Boyama ile başlamak için, eksi 80 santigrat derece slaytlar çıkarmak ve bölümleri hava-kurutmak için bir saat oda sıcaklığında tutun.Oct'yi yıkamak ve bölümleri permeabilize etmek için slaytları her biri beş dakika boyunca üç kez %0,1 PBST'de durulayın. Her slayta 200 mikrolitre bloklama çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatın. Ardından, slaydı durulamadan engelleme çözümlerini kaldırın.Her slayt için engelleme çözeltisi seyreltilmiş birincil antikor 100 mikrolitre ekleyin ve dört santigrat derece gecede kuluçka. Slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca pbs ile üç kez durulayın. Bloklama çözeltisinde seyreltilmiş 100 mikrolitre ikincil antikor ekleyin ve ışıktan korunan oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın.PBS'de her biri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca üç kez durulayın, hala ışıktan korunun. Slaytları monte etmek için, her slayta DAPI ile iki damla solmaya karşı orta ekleyin, kapak kapağını bir kapak la kaplayın ve görüntüye hazır olana kadar dört derece santigrat derecede saklayın. Kontrol embriyolarının frontal kemikleri pSmad1/5/9, downstream BMP sinyal faktörleri ve hücre proliferasyonu belirteci Ki67 pozitifti.Nöral krest spesifik, konstitutively aktive BMPR1A mutant embriyolar, ancak, ki67 düzeyleri azalmış iken pSmad1/5/9 düzeyleri artırıldı. Ayrıca mutant embriyoların ön kemiklerinde kontrol embriyolarına göre daha fazla apoptotik hücre gözlenmiştir. Jelatin gömülü kafaların koronal kriyokesitleri, burun kemiği ve burun dokularında bulunan bir tdTomato kasetinden gfp sinyali ve RFP sinyalini açıkça göstererek jelatinin floresan sinyalleri etkilemediğini gösterir.Bu kesitler SOX9 veya Osterix ve E11/Podoplanin için immünosüllere büründüğünde, üç haftalık sert dokuların çoğundan kaliteli kesitler elde edildi. Öte yandan, üç aylık örneklerle, femur, burun dokuları ve kafatasının trabeküler bölmesi de dahil olmak üzere sert dokuların sadece bazılarında nazal-premaxilla sütür ve başın çevresindeki kemikler de dahil olmak üzere kaliteli bölümler elde edilebildi. SOX9-pozitif hücreler özellikle büyüme plakası kondrositlerinde ve femur ve nazal septumdan eklemde saptandı.Üç haftalık kesici dişlerde mezenkimal hücrelerde SOX9 saptırıldı. Osterix ve E11 çift boyama sonuçları Osteoblastlarda Osterix saptandığını, E11'in ise femur ve baş kemik osteositlerinde saptandığını göstermektedir. Üç haftalık kesici dişlerde Osterix odontoblastlarda pozitif, folikül mezenkimal hücrelerinde E11 pozitifti.Lütfen %4 PFA ile numuneleri aşırı düzeltmeyin. Jelatinde çözülmemiş sert dokuların kesiti için en iyi sıcaklık eksi 25 santigrat derece ve daha düşüktür. Bu prosedürü takiben, floresan düzeyleri protokolümüzde açıklandığı gibi ölçülebilir.Bu ölçümler, farklı gruplar arasındaki protein ingöreceli düzeyinin farkını göstermek için bilgilendirici veriler sağlayacaktır. Bu teknik, geliştirildikten sonra farklı proteinlerin ortak ifade kalıplarını elde etmek için çift veya üçlü boyamanın önünü açmıştır. %4 PFA tehlikelidir.Bu cilt alerjileri neden olabilir, ciddi göz hasarı, organ hasarları, veya kanser. Lütfen kişisel koruyucu ekipmanlar kullanın ve kullanımdan sonra cildi iyice yıkayın.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Automated Quantification of Hematopoietic Cell ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“ Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generating Primary Fibroblast Cultures from Mouse Ear and Tail Tissues

Fare Kulak ve Kuyruk Dokular Yaratma İlköğretim Fibroblast Kültürleri

Primary cells are derived directly from tissue and are thought to be more representative of the physiological state of cells in vivo than established cell ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

Diseksiyon ve fare hipofiz bezi geliştirme koronal dilim hazırlık

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration

Nöral Krest Hücre Delaminasyonu ve Göçü Çalışması İçin Fareden Birincil Kranial Nöral Krest Hücrelerinin Diseksiyonu, Kültürü ve Analizi

Over the past several decades there has been an increased availability of genetically modified mouse models used to mimic human pathologies. However, the ...

Clonal Genetic Tracing using the Confetti Mouse to Study Mineralized Tissues

Mineralize Dokuları Incelemek için Konfeti Faresini Kullanarak Klonal Genetik İzleme

Labeling an individual cell in the body to monitor which cell types it can give rise to and track its migration through the organism or determine its ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Gen Ekspresyonu Analizi için Fare Embriyonik Kıkırdağı ve Kemiğinin Lazer Yakalama Mikrodizmesi

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...