Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

الكتاب أود أن أشكر أعضاء المختبر الإجمالي لتعليقات مفيدة في هذه المخطوطة. ونود أن نعترف بأربعة من طلاب المدارس الثانوية الذين يستخدم هذا البروتوكول خلال التدريب الصيفي في عام 2017 و 2018، بما في ذلك كريستين تساو وناظر مايكل ولي Aki وديفيد نوانكوو. وأيد HL زمالة "الجذعية البيولوجيا جامعة كاليفورنيا" خلال صيف عام 2017. كان يؤيد هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم (ديب-1457630 إلى JBG)، والمعاهد الوطنية لطب الأسنان والجمجمة البحوث (المعاهد الوطنية للصحة؛ DE025033 إلى JBG).

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة سينسيناتي (البروتوكول رقم 10-01-21-01).
1-التثبيت
<ol><li>عزل العدد المطلوب من الأجنة أستياناكس مكسيكي من خزان لتربية وإصلاح الأجنة ~ 50 في وقت واحد. إذا الأجنة الكبيرة والقديمة، قد يكون م...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

نظراً لضعف الجيش الملكي النيبالي للتدهور، إحدى الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول يتعلق بتوليف العقيمة لمسبار الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، إذا كان تحقيق يتم إنشاؤها بعناية، ويقدم نتائج جيدة، فإنه يمكن إعادة استخدامها في ردود المصبوغة لاحقة. خطوة حاسمة ثانية هو إنتاج دقيق لجميع الكواشف ...

التهجين في الموقع أسلوب شائع لتلطيخ الأنسجة الثابتة لتصور أنماط التعبير الجيني1. وقد أجريت هذه التقنية للسنوات الأخرى التقليدية2 و غير التقليدية3 نظم نموذجية، لمجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ومع ذلك، العديد من الخطوات والكاشفات ضرورية لنجاح تنفيذ هذا الإجراء. للمحققين الذين أدوا ابدأ هذا الأسلوب، يمكن الشروع في العملية تخويف نظراً للخطوات العديدة التي ينطوي عليها. علاوة على ذلك، طبيعة هذه الإجراءات المطولة يفسح المجال للأخطاء التقنية، التي يمكن أن يكون تحديا لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
والهدف العام لهذه المادة هو تقديم أسلوب بسيط ومباشر سوف تجعل هذه التقنية التهجين متاحة لجمهور واسع. للحد من إدخال أخطاء، نقدم نهجاً واضحة غلة تلطيخ التعبير الجيني عالية الجودة ويقلل من الإشارات الخلفية غير محددة. هذا الإجراء مماثل للنهج الأخرى المتقدمة في نظم النموذج التقليدي، مثل دانيو rerio4. هنا، نحن نهدف إلى تسهيل التنفيذ الدقيق لكل خطوة باستخدام قائمة مرجعية لتحميل (تكميلية ملف 1)، النهوض بالتنفيذ الدقيق للبروتوكول. والأساس المنطقي لذلك تيسير المنظمة من خلال العديد من الخطوات المتعلقة بهذا الإجراء. هذا المقال مناسب للباحثين المهتمين في أداء الجامعة-جبل التهجين في الموقع في تطوير الأجنة، ولكن لا إجراء بعد الإجراء. وميزة النهج الذي تم اختياره للباحثين أستياناكس هو أنه قد تم اختبارها وأثبتت في كل من كافيفيش ونقرأ الأسماك السطحية، مما يسهل إجراء تحليلات مقارنة التعبير. طريقة عرض يمكن أن يستخدمها الباحثون في الدراسات أستياناكس وغيرها من النظم.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

في السنوات الأخيرة، صدرت مشروع جينوم ل cavefish المكسيكية المكفوفين (مكسيكي أستياناكس)، الكشف عن هويات تسلسل لآلاف جينات. رسملة البحوث السابقة في هذا النظام النموذجي الناشئة على إجراء تحقيقات شاملة على نطاق الجينوم التي حددت عديدة السمات الكمية المكاني (QTL) المرتبطة بشتى تعمل المرتبطة بالكهف. بيد أن القدرة على الاتصال الجينات التي تهم بالأساس الموروثة لتغيير المظهرية لا يزال يشكل تحديا كبيرا. هو أسلوب واحد يمكن أن تيسر فهم أعمق لدور التنمية في تطور تروجلومورفيك الجامعة-جبل التهجين في الموقع. يمكن تنفيذ هذا الأسلوب مباشرة مقارنة التعبير الجيني بين أشكال الكهف وسطح المسكن، وترشيح الجينات الكامنة أنشئت QTL، تحديد الجينات للفائدة من الدراسات تسلسل الجيل القادم، أو تطوير أخرى النهج القائم على الاكتشاف. وفي هذا التقرير، نقدم بروتوكول بسيط، تدعمها قائمة مرجعية مرنة، يمكن تكييفها على نطاق واسع للاستخدام خارج نظام الدراسة المقدمة. ونأمل أن هذا البروتوكول يمكن أن تخدم كمورد واسعة للمجتمع أستياناكس وما بعدها.

وفي هذا التقرير، نقدم نهجاً بسيطاً ومباشرا للقيام بوضع العلامات الجنينية أستياناكس عينات لتحليل التعبير الجيني عالية الجودة. هذا الأسلوب يمكن أن تنفذ في أربعة أو خمسة أيام، ويتم تمثيل كل خطوة رئيسية في الإجراء في مخطط انسيابي مرمزة (الشكل 1). عند الا?...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

ويتيح هذا البروتوكول التصور للتعبير الجيني في الجنينية أستياناكس كافيفيش. وقد وضعت هذا النهج مع الهدف المتمثل في تعظيم إشارة تعبير الجينات، مع التقليل من تلوين الخلفية غير محددة.

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

بروتوكولنا في الموقع مهم لأنه يوفر طريقة مباشرة لتصور أنماط التعبير الجيني مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. هذه التقنية يجعل بروتوكول معقدة وطويلة نسبيا من السهل تنفيذ. Benchtop إعداد الاقتراحات والقوائم المرجعية المقدمة تجعل هذا البروتوكول حتى أسهل لأداء بشكل صحيح وإعادة إنتاج.في حين أن التقنيات المعروضة هنا هي محددة إلى المكسيكية Astyanax، فإنه من المرجح أن تتكيف مع أنظمة أخرى من الأفراد الحجم بالمقارنة مع تعديلات صغيرة على البروتوكول. أولاً، استخدم شريط مختبر ملون لتعيين قوارير وماصات لكل جين. باستخدام ماصة باستور، فرز الأجنة.لا يوجد عادة أكثر من 12 جنيناً لكل قارورة، يتم فرزها بمجرد فرزها. المقبل، تعيين حمام مائي اهتزاز إلى 70 درجة مئوية. بعناية استخلاص الميثانول في قارورة من أجنة فرزها، واستبداله مع 500 ميكرولتر من الميثانول 100٪ الطازجة.غسل الأجنة لفترة وجيزة لمدة دقيقة واحدة تقريبا على منصة شاكر. بعد ذلك، اُعاد هيدرات الأجنة بتركيز متزايد من 1x PBS مع Tween 20 على منصة شاكر كما هو موضح في بروتوكول النص. للبدء، ضع طوقاً صغيراً مع قاع شبكي في حمام الماء الدوار الذي تم تسخينه مسبقاً إلى 70 درجة مئوية.مكان aliquots من العازلة التهجين ناقص والتخزين المؤقت بالإضافة إلى في طوقا. أضف محلول PK المعدة بلطف إلى قارورة الأجنة لضمان تغطية جميع الأنسجة بالكامل في المحلول. نقل قارورة إلى منصة شاكر والسماح لهم هضم في محلول عمل البروتينات K لمدة 12 دقيقة تقريبا.بعد هذا، سحب بلطف قبالة حل PK والفيضانات لفترة وجيزة القارورة مع PBT لتخفيف PK المتبقية. استبدال حل PBT مع 500 ميكرولترات من PBT الطازجة والسماح للشطف الحل على منصة شاكر لمدة خمس دقائق. ثم استبدال حل PBT مع 500 ميكرولترات من 4٪ PFA المذابة. دع الأجنة تحتضن على المنصة شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.لبدء مرحلة ما قبل التهجين، إضافة 500 ميكرولترات من العازلة التهجين قبل الدفء ناقص حل إلى قارورة تحتوي على الجنين. ضع القنينات بعناية في طوقا في الحمام المائي عند درجة حرارة 70 درجة مئوية دون أن تهتز لمدة خمس دقائق. المقبل سحب قبالة العازلة التهجين ناقص الحل والفيضانات قوارير مع 500 microliters من العازلة التهجين مسبقا بالإضافة إلى حل.ضع القنينات مرة أخرى في طوقا في الحمام المائي واحتضان مع اهتزاز إما لمدة أربع ساعات أو بين عشية وضحاها. لبدء التهجين، رسم العازلة التهجين زائد من قارورة واستبدالها مع 500 ميكرولترات من جديد قبل الدفء العازلة التهجين زائد. إضافة بعناية اثنين من ميكرولترات من المسبار RNA إلى كل قارورة ودوامة بلطف لضمان توزيع حتى من التحقيق.احتضان في حمام مائي في 70 درجة مئوية بين عشية وضحاها بينما تهتز في 40 دورة في الدقيقة. للبدء، وإعداد أنابيب microcentrifuge المسمى العازلة التهجين بالإضافة إلى جين من مصلحة الجيش الملكي النيبالي التحقيق كما هو مبين في بروتوكول النص. تعيين اثنين من أنابيب المخروطية 15 ملليلتر وإضافة 0.2 غرام من الكاشف منع و 10 ملليلتر من مابت.ضع كلا الأنبوبين على خلاطة المكسرات حتى يذوب الكاشف تمامًا في المحلول. باستخدام ماصة باستور الزجاج سحب قبالة العازلة التهجين بالإضافة إلى حل التحقيق ووضعها في أنبوب microcentrifuge معقم المسمى. تخزين هذا الأنبوب في الثلاجة في ناقص 20 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.إضافة بعناية 500 ميكرولترات من سيترات الصوديوم المالحة الدافئة والتهجين العازلة ناقص التخفيف. احتضان في حلول متتابعة لمدة 10 دقائق كل في حمام الماء تهتز، ومن ثم في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر كما هو مبين في بروتوكول النص. بعد الحضانة الأخيرة، استبدال PBT 100٪ من كل قارورة مع 500 ميكرولترers من مابت.كرر هذه العملية مرتين لمدة خمس دقائق لكل من هذه. أولاً، قم بإزالة MABT من كل قارورة وغمرها بمحلول الحجب المائل من أحد الأنابيب المخروطية ذات الـ 15 ملليلتر. ضع كل من القنينات على خلاط المكسرات لمدة أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.إضافة اثنين microliters من شظايا الأجسام المضادة إلى أنبوب الثاني من محلول الحجب المعدة ودوامة لفترة وجيزة. ثم ملء كل قارورة تماما تقريبا مع حل منع ووضعها على خلاط nutating بين عشية وضحاها في ثلاجة في أربع درجات مئوية. للبدء، إعداد قارورة الأسهم من 10٪ NGS في MABT.استبدل حل الحجب في كل قارورة بـ 500 ميكرولترات من هذا الحل NGS. احتضان في درجة حرارة الغرفة على منصة شاكر لمدة 25 دقيقة. بعد ذلك، استبدل خليط NGS بـ 500 ميكروليتر من 100٪ مابت.احتضان على منصة شاكر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. كرر هذا شطف 11 مرة أخرى على مدار اليوم، كل 30 دقيقة. ثم ملء كل قارورة مع 100٪ MABT ووضعها على خلاط nutating بين عشية وضحاها في ثلاجة في أربع درجات مئوية.أولاً، استبدل مابت في كل قارورة بميليلتر واحد من مخزن AP المؤقت واتركه يغسل لمدة خمس دقائق. كرر هذا الغسيل مرتين لإزالة مابت تماما. ثم استبدال المخزن المؤقت AP مع ملليلتر واحد من المخزن المؤقت AP الطازجة التي تحتوي على 3.5 ميكرولترات من BCIP و 4.5 ميكرولترات من MBT.استبدل هذا بمزيج جديد من المخزن المؤقت AP يحتوي على BCIP و MBT كل ساعة حتى يكتمل التفاعل ، مع التأكد من مراقبة التفاعل عن كثب والتحقق من كل 15 دقيقة حتى يتم تحقيق المستوى المطلوب من التلوين. وقف رد فعل تلوين عن طريق شطف الأجنة في تركيز متزايد من 1X PBT في العازلة AP كما هو مبين في البروتوكول. شطف الأجنة في ما يقرب من خمسة ملليلتر من 100٪ PBT على خلاط nutating حتى يتم التوصل إلى الحد الأدنى المطلوب تلطيخ الخلفية.عندما يكتمل الشطف ، قم بغسل الأجنة في 500 ميكرولترات من PBS العقيمة على شاكر منصة و postfix العينات كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد شطف الأجنة، ووضعها في أربعة ملليلتر من 100٪ برنامج تلفزيوني معقمة وإذا لزم الأمر تخزينها على المدى الطويل عند أربع درجات مئوية. في هذه الدراسة يتم تصنيف عينات Astyanax الجنينية لتحليل التعبير الجيني عالي الجودة.وقد تم تنفيذ هذه العملية بنجاح في كل من أسماك الباشون الكهفية وأجنة الأسماك السطحية. أجنة سمك الكهف المسمى للتعبير Sox9 إظهار وضع علامات واضحة في الأقواس الفرعية النامية والزعنفة الصدرية. لاحظ أن التلطيخ غائب تقريبا في كيس صفار أو somites النامية على الجناح.وبالمثل، فإن تعبير Tfap2a واضح في أجزاء من الرأس النامية كخلايا قمة عصبية مبكرة للهجرة على طول منطقة الجناح الظهري للجنين. وينظر إلى الجين الثالث المقدمة لأجنة سمك الكهف، Phf20a، في أجزاء من mesoderm الجسدية والرأس الخلفي التي متجهة إلى أن تؤدي إلى الأنسجة العظمية. تظهر أجنة الأسماك السطحية التي تحمل علامة CXCR وضع علامات إيجابية في المناطق المعزولة من الرأس والجناح ، بالإضافة إلى عدد قليل من الخلايا الفردية التي تُحيط كيس الصفار.يتم التعبير عن الجين Adcyap1a في مناطق الجهاز العصبي المركزي بما في ذلك الخلايا النخامية. لاحظ التعبير الخاص للغاية في مجموعات ثنائية ثنائية من الخلايا على الجانب الظهري للجنين، بالإضافة إلى منطقة أكبر من التعبير المتوسط. الجين الأخير الذي تم فحصه لأجنة سمك الكهف ، Sox10 ، واضح كعلامة مبكرة لل قمة عصبية على الجانبين الأيسر والأيمين للجنين الظهري.بعد الانتهاء في الموقع، ونحن عادة صورة نتائجنا باستخدام المجهر الخفيفة. من الأفضل القيام بذلك في غضون أسبوعين بعد الانتهاء من أجل تجنب تدهور تلطيخ.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

فهم توالد المبكر باستخدام المبسطة<em&gt; في الموقع</em&gt; بروتوكول التهجين في<em&gt; القيطم</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

متعددة الهدف اللونية الجامع جبل<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين لمقارنة الجينات مجالات التعبير في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

تصور الخلايا مولتيسيلياتيد في الزرد من خلال بروتوكول مجتمعة في الموقع كله جبل فلوري التهجين والفلوره

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

استخدام Fluorescence في الموقع التهجين (الأسماك) لرصد حالة التماسك الذراع في بروميتافاسي والطوريه وأنا بويضات المورفولوجية

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

الجينوبة والقياس الكمي للتهجين في الموقع تلطيخ في حمار وحشي

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

التهجين الكامل في الموقع في أجنة حمار وحشي وأنبوب تشكيل اساي في iPSC-ECs لدراسة دور Endoglin في التنمية الوعائية

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

تصوير الكالسيوم الفلوري والتهجين في الموقع اللاحق لتوصيف السلائف العصبية في زينوبوس laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

تغييرات درجة الحرارة الإضافية لتكاثر القصوى والتفريخ في أستياناكس المكسيكي

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...