Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke medlemmerne af de grove lab for nyttige kommentarer på dette håndskrift. Vi vil gerne anerkende fire gymnasieelever, der udnyttede denne protokol i løbet af sommeren praktikpladser i 2017 og 2018, herunder Christine Cao, Michael Warden, Aki Li og David Nwankwo. HL blev støttet af en UC biologi STILK Fellowship i løbet af sommeren i 2017. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Science Foundation (DEB-1457630 til JBG), og de nationale institutter for Dental og Craniofacial forskning (NIH; DE025033 til JBG).

Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Cincinnati (protokol #10-01-21-01).
1. fiksation
<ol><li>Isolere ønskede antal Astyanax mexicanus embryoner fra en formering tank og fastsætte ~ 50 embryoner på en gang. Hvis embryoner er store og gamle, kan det være nødvendigt at fastsætte 25 på et tidspunkt at sikre selv fiksering.</li>
	<li>Afhængigt af alder af embryonet, udnytte metoden IACUC-godkendt af...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

På grund af sårbarheden af RNA til nedbrydning vedrører et af de mest kritiske trin i protokollen sterile syntesen af RNA sonden. Men hvis en sonde genereres omhyggeligt, og giver gode resultater, det kan genbruges i efterfølgende farvning reaktioner. Et andet afgørende skridt er forsigtige produktionen af alle reagenser, der anvendes i hele protokollen. Da denne protokol omfatter flere dage og mange små skridt, det er vigtigt at alle reagenser er præcist produceret og gemt i en steril måde. Endvidere er det vigt...

In situ hybridisering er en fælles metode for farvning faste væv for at visualisere gen expression mønstre1. Denne teknik er blevet udført i år i andre traditionelle2 og ikke-traditionelle3 modelsystemer, for en bred vifte af biologiske undersøgelser. Dog er flere trin og reagenser, der nødvendige for at fuldføre denne procedure. For efterforskerne, der aldrig har udført denne teknik, kan indlede processen være skræmmende på grund af de mange trin involveret. Yderligere, den langvarige karakter af denne procedure egner sig til tekniske fejl, som kan være en udfordring for at fejlfinde.
Det overordnede mål med denne artikel er at præsentere en enkel og ligetil metode, der vil gøre denne hybridisering teknik har adgang til et bredt publikum. For at reducere indførelsen af fejl, præsenterer vi en enkel tilgang, der giver høj kvalitet gen expression farvning og minimerer uspecifikke baggrund signal. Denne procedure er magen til andre metoder udviklet i traditionelle modelsystemer, såsom Danio rerio4. Her, vi sigter mod at lette omhyggelig gennemførelse af hvert trin ved hjælp af en downloades tjekliste (supplerende fil 1), at fremme omhyggelig gennemførelse af protokollen. Begrundelsen herfor er at lette organisation gennem de mange trin i denne procedure. Denne artikel er relevant for forskere interesseret i at udføre hele-mount in situ hybridisering i udviklingen af embryoner, men endnu har udført ikke proceduren. Fordelen ved den valgte metode for Astyanax forskere er at det er blevet testet og bevist i både cavefish og overflade fisk morphs, hvilket letter sammenlignende udtryk analyser. Metoden præsenteres kan bruges af forskere i undersøgelser af Astyanax og andre systemer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

I de seneste år, er et udkast til genom for den blinde mexicanske cavefish (Astyanax mexicanus) blevet frigivet, afslørende sekvens identiteter for tusindvis af gener. Tidligere forskning i denne nye modelsystem kapitaliseres på omfattende genome-wide undersøgelser, der har identificeret talrige kvantitative træk loci (QTL) forbundet med forskellige cave-associerede fænotyper. Evnen til at forbinde gener af interesse til den arvelige basis for fænotypisk ændring er dog en betydelig udfordring. En teknik, der kan lette dybere forståelse af rollen, som udviklingen i troglomorphic evolution er hele-mount in situ hybridisering. Denne teknik kan gennemføres for at direkte sammenligne genekspression mellem hule og flade bolig former, nominere kandidat gener underliggende etablerede QTL, identificere gener af interesse fra næste generation sequencing undersøgelser eller udvikle andre Discovery-baserede tilgange. I denne betænkning præsenterer vi en enkel protokol, understøttes af en fleksibel tjekliste, som kan tilpasses bredt til brug langt ud over præsenteres undersøgelse system. Det er håbet, at denne protokol kan tjene som en omfattende ressource for Fællesskabets Astyanax og videre.

I denne betænkning leverer vi en enkel og ligetil tilgang til at udføre mærkning af embryonale Astyanax enheder til høj kvalitet gen expression analyse. Denne teknik kan udføres i enten fire eller fem dage, og hvert vigtigste trin i proceduren er repræsenteret i et farvekodet diagram (fig. 1). Når du er færdig, skal farves embryoner havnen en mørk lilla kromatisk etiket i væv udtrykker den bestemt gen af interesse. Vi har med succes gennemf...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Denne protokol giver mulighed for visualisering af genekspression i embryonale Astyanax cavefish. Denne fremgangsmåde er blevet udviklet med formålet at maksimere gen expression signal, samtidig minimere uspecifikke baggrund farvning.

Wholemount i Situ hybridisering til Astyanax embryoner

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Vores in situ protokol er vigtig, fordi det giver en enkel måde at visualisere genekspressionsmønstre med minimal baggrundsplejning. Denne teknik gør en kompliceret og langvarig protokol relativt let at udføre. Benchtop oprette forslag og tjeklister forudsat gøre denne protokol endnu lettere at udføre korrekt og reproducere.Mens de teknikker, der vises her er specifikke for Astyanax mexicanus, det kunne sandsynligvis blive tilpasset til andre systemer af sammenligneligt størrelse personer med små justeringer af protokollen. Først skal du bruge farvet lab tape til at udpege hætteglas og pipetter for hvert gen. Ved hjælp af en Pasteur pipette, sortere embryoner.Der er normalt ikke mere end 12 embryoner pr. hætteglas, når de er sorteret. Dernæst indstille en rystende vandbad til 70 grader Celsius. Træk forsigtigt methanolen ud i hætteglassene af sorterede embryoner, og udskift den med 500 mikroliter friske 100% methanol.Vask embryonerne kortvarigt i ca. et minut på en platformsshaker. Derefter rehydreres embryonerne i en stigende koncentration på 1x PBS med Tween 20 på en platformsryser som beskrevet i tekstprotokollen. Til at begynde, placere en lille pakning med en mesh bund i det roterende vandbad, der er blevet forvarmet til 70 grader Celsius.Placer aliquots af hybridisering buffer minus og hybridisering buffer plus i pakningen. Tilsæt forsigtigt en forberedt PK-opløsning til embryoners hætteglas, der sikrer, at alt væv er helt dækket af opløsningen. Overfør hætteglassene til en platformsshaker, og lad dem fordøje proteinase K-arbejdsopløsningen i ca. 12 minutter.Derefter trækkes PK-opløsningen forsigtigt af, og hætteglasset med PBT opvarmes kortvarigt for at fortynde den resterende PK. Udskift PBT-opløsningen med 500 mikroliter frisk PBT, og lad opløsningen skylle på perronrysteleren i fem minutter. Udskift derefter PBT-opløsningen med 500 mikroliter optøet 4% PFA. Lad embryonerne inkubere på perronrysteren ved stuetemperatur i 20 minutter.For at begynde pre-hybridisering, tilsæt 500 mikroliter af forvarmet hybridisering buffer minus opløsning til embryo-holdige hætteglas. Læg forsigtigt hætteglassene i pakningen i vandbadet ved 70 grader Celsius uden at ryste i fem minutter. Næste trække ud hybridisering buffer minus løsning og oversvømme hætteglas med 500 mikroliter af forvarmet hybridisering buffer plus løsning.Læg hætteglassene tilbage i pakningen i vandbadet og inkuber med omrystning enten i fire timer eller natten over. For at begynde hybridisering, trække hybridisering buffer plus ud af hætteglassene og erstatte det med 500 mikroliter af frisk prewarmed hybridisering buffer plus. Tilsæt forsigtigt to mikroliter RNA-sonde til hvert hætteglas og hvirvler forsigtigt for at sikre en jævn fordeling af sonden.Inkubere i vandbadet ved 70 grader Celsius natten over, mens ryste ved 40 RPM. Til at begynde, forberede mikrocentrifuge rør mærket hybridisering buffer plus med genet af interesse RNA sonde som skitseret i tekstprotokollen. Der er to koniske rør på 15 milliliter, og der tilsættes 0,2 g blokerende reagens og 10 milliliter MABT.Begge rør anbringes på en nøddeblanding, indtil reagenset er helt opløst i opløsningen. Ved hjælp af et glas Pasteur pipette trække hybridisering buffer plus og sonde løsning og placere den i en steril mærket mikrocentrifuge rør. Opbevar dette rør i fryseren ved minus 20 grader Celsius til fremtidig brug.Tilsæt forsigtigt 500 mikroliter af den varme saltvandsnatriumcitrat og hybridiseringsbuffer minusfortyndinger. Inkuberes i sekventielle opløsninger i 10 minutter hver i rystende vandbad, og derefter ved stuetemperatur på en platform shaker som skitseret i tekstprotokollen. Efter den sidste inkubation erstattes 100%PBT fra hvert hætteglas med 500 mikroliter MABT.Gentag denne proces to gange i fem minutter hver. Først skal du fjerne MABT fra hvert hætteglas og oversvømme det med forblandet blokerende opløsning fra en af de 15-milliliter koniske rør. Anbring begge hætteglas på nøddeblandingen i fire timer ved stuetemperatur.Der tilsættes to mikroliter af antistoffragmenterne til det andet rør af forberedt blokerende opløsning og kortvarigt vortex. Derefter fylde hvert hætteglas næsten helt med blokerende opløsning og læg dem på en nøddeblandingsmaskine natten over i et køleskab ved fire grader Celsius. Til at begynde, forberede en bestand hætteglas på 10% NGS i MABT.Sæt blokeringsopløsningen i hvert hætteglas ud med 500 mikroliter af denne NGS-opløsning. Inkuber ved stuetemperatur på perronshakeren i 25 minutter. Derefter erstattes NGS-blandingen med 500 mikroliter på 100%MABT.Inkuber på perronrykeren ved stuetemperatur i 30 minutter. Gentag denne skyl 11 gange mere i løbet af dagen, hver 30 minutter. Fyld derefter hvert hætteglas med 100% MABT og læg dem på en nutating mixer natten over i et køleskab ved fire grader Celsius.Først skal MABT udskiftes i hvert hætteglas med en milliliter AP-buffer, og lad det vaske i fem minutter. Gentag denne vask to gange for helt at fjerne MABT. Derefter erstattes AP-bufferen med en milliliter frisk AP-buffer, der indeholder 3,5 mikroliter BCIP og 4,5 mikroliter MBT.Udskift dette med en frisk blanding af AP buffer, der indeholder BCIP og MBT hver time, indtil reaktionen er færdig, og sørg for at overvåge reaktionen nøje og kontrollere hvert 15. Stop farvereaktionen ved at skylle embryonerne i en stigende koncentration af 1X PBT i AP-buffer som beskrevet i protokollen. Skyl embryonerne i ca. fem milliliter 100%PBT på en nøddeblanding, indtil den ønskede minimumsfarvning af baggrunden er nået.Når skylningen er færdig, vaskes embryonerne i 500 mikroliter steril PBS på en platformsshaker, og prøverne sættes efter dem som beskrevet i tekstprotokollen. Efter skylning af embryonerne, læg dem i fire milliliter 100% steril PBS og om nødvendigt opbevare dem på lang sigt ved fire grader Celsius. I denne undersøgelse embryonale Astyanax prøver er mærket for høj kvalitet genekspression analyse.Denne proces er blevet gennemført med succes i både Pachon hulefisk og overflade fisk embryoner. Cavefish embryoner mærket for Sox9 udtryk demonstrere klar mærkning i udviklingslandene branchial buer og brystfinne. Bemærk, at farvning er næsten fraværende i blomme sæk eller udvikle somites på flanken.Tilsvarende Tfap2a udtryk er tydeligt i de dele af udviklingslandene hovedet som tidlig migration neurale crest celler langs dorsale flanke region af fosteret. Det tredje gen præsenteret for hulefisk embryoner, Phf20a, ses i de dele af den somatiske mesoderm og posterior hoved, der er bestemt til at give anledning til knoklet væv. Overflade fisk embryoner mærket til CXCR viser positiv mærkning i isolerede områder af hoved og flanke, samt et par individuelle celler overliggende æggeblomme sæk.Genet Adcyap1a udtrykkes i områder af centralnervesystemet, herunder hypofyse celler. Bemærk det meget specifikke udtryk i parrede bilaterale klynger af celler på fosterets dorsale aspekt samt en større region med midterlinjeudtryk. Det sidste gen undersøgt for hulefisk embryoner, Sox10, er indlysende som en tidlig markør for neurale crest på venstre og højre side af dorsale embryo.Efter at have afsluttet in situ, vi typisk billede vores resultater ved hjælp af lys mikroskopi. Det er bedst at gøre dette inden for to uger efter afslutningen for at undgå nedbrydning af farvning.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forståelse Tidlig Organogenesis efter en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridization protokol<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering til sammenligning genekspression domæner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i zebrafisk gennem en kombineret protokol af hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og immunfluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Ved hjælp af fluorescens In Situ hybridisering (FISH) til at overvåge status for Arm samhørighed i Prometaphase og metafase jeg Drosophila oocyter

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genoyping og kvantificering af In Situ Hybridization Farvning i Zebrafisk

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridization i Zebrafish Embryoner og Tube Formation Assay i iPSC-ECs at studere den rolle, Endoglin i vaskulær udvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumimaging og efterfølgende In Situ Hybridisering for neuronal precursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Trinvise temperaturændringer for maksimal avl og gydning i Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...