Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

De auteurs bedank leden van de bruto lab voor nuttige opmerkingen op dit manuscript. Wij willen vier middelbare schoolstudenten die dit protocol tijdens de zomer stages in 2017 en 2018 gebruikt, met inbegrip van Christine Cao, Michael Warden, Aki Li en David Nwankwo erkennen. HL werd gesteund door een UC biologie stam Fellowship in de zomer van 2017. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Science Foundation (DEB-1457630 aan de JBG), en de nationale instituten van tand- en craniofaciale onderzoek (NIH; DE025033 aan de JBG).

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de Universiteit van Cincinnati (Protocol #10-01-21-01).
1. fixatie
<ol><li>Gewenste aantal Astyanax mexicanus embryo's uit een tank van fokken te isoleren en op te lossen ~ 50 embryo's tegelijk. Als embryo's groot en oude zijn, wellicht 25 tegelijk om ervoor te zorgen zelfs fixatie vast te stellen.</li>
	<li>Afhankelijk van de leeftijd van het embryo, gebruik m...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

Vanwege de kwetsbaarheid van RNA voor afbraak betreft een van de belangrijkste stappen in het protocol de steriele synthese van de RNA-sonde. Echter, als een sonde zorgvuldig wordt gegenereerd, met goede resultaten, kan het worden hergebruikt in latere kleuring reacties. Een tweede cruciale stap is de zorgvuldige productie van alle reagentia in het gehele protocol gebruikt. Aangezien dit protocol betrekking heeft op verschillende dagen en veel kleine stapjes, is het essentieel dat alle reagentia nauwkeurig worden geprodu...

Kruising in situ is een gemeenschappelijke methode voor de kleuring van vaste weefsels om te visualiseren van gen expressie patronen1. Deze techniek heeft jarenlang in andere traditionele2 - en niet-traditionele3 modelsystemen, voor een verscheidenheid van biologische studies verricht. Er zijn echter verschillende stappen en reagentia moet deze procedure uitvoeren. Voor onderzoekers die deze techniek nog nooit hebt uitgevoerd, kan starten van het proces worden intimiderende als gevolg van de vele stappen. Verder, het langdurige karakter van deze procedure leent zich voor technische fouten, die kunnen lastig zijn om op te lossen.
Het algemene doel van dit artikel is om een eenvoudige en ongecompliceerde methode die zal deze kruising techniek voor een breed publiek toegankelijk te maken. Verklein de invoering van fouten en presenteren we een eenvoudige benadering die levert hoge kwaliteit gen expressie kleuring en minimaliseert aspecifieke achtergrond signaal. Deze procedure is vergelijkbaar met andere benaderingen ontwikkeld in traditionele modelsystemen, zoals Danio rerio4. Hier, streven wij naar het vergemakkelijken van zorgvuldige uitvoering van elke stap met behulp van een downloadbare checklist (aanvullende bestand 1), zorgvuldige uitvoering van het protocol te bevorderen. De reden hiervoor is het vergemakkelijken van de organisatie door middel van de vele stappen die betrokken zijn bij deze procedure. Dit artikel is geschikt voor onderzoekers ook geïnteresseerd in het uitvoeren van geheel-mount kruising in situ in het ontwikkelen van embryo's, maar de procedure nog niet hebben uitgevoerd. Het voordeel van de gekozen aanpak voor Astyanax onderzoekers is dat het is getest en in zowel cavefish en oppervlakte vissen morphs bewezen, teneinde vergelijkende expressie analyses. De onderhavige methode kan worden gebruikt door onderzoekers in studies over Astyanax en andere systemen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

In de afgelopen jaren heeft het genoom van een ontwerp voor de blinde Mexicaanse cavefish (Astyanax mexicanus) vrijgegeven, onthullen de identiteit van de reeks voor duizenden genen. Voorafgaande onderzoek naar deze opkomende modelsysteem gekapitaliseerd op uitgebreide genoom-brede onderzoeken, die talrijke kwantitatieve trait loci (QTL) die is gekoppeld aan verschillende grot-geassocieerde fenotypen hebben geïdentificeerd. De mogelijkheid om de erfelijke basis voor verandering van de fenotypische verbinden met de genen van belang blijft echter een aanzienlijke uitdaging. Een techniek die dieper begrip van de rol van ontwikkeling in de evolutie van de troglomorphic vergemakkelijken kan is geheel-mount kruising in situ. Deze techniek kan worden toegepast om rechtstreeks vergelijken van genexpressie tussen grot - en oppervlakte-woning vormen, kandidaat benoemen genen onderliggende gevestigde QTL, identificeren van genen van belang van volgende-generatie sequencing studies of ontwikkelen van andere ontdekking-gebaseerde benaderingen. In dit verslag stellen we een eenvoudig protocol, ondersteund door een flexibele controlelijst, die wijd aangepast voor gebruik goed buiten het gepresenteerde studie-systeem worden kan. Gehoopt wordt dat dit protocol als een grote bron voor de Astyanax -Gemeenschap en daarbuiten dienen kan.

In dit verslag geven wij een eenvoudige en ongecompliceerde benadering standaardinteracties labeling van embryonale Astyanax specimens voor kwalitatief hoogwaardige gen expressie analyse. Deze techniek kan worden uitgevoerd in vier of vijf dagen, en elke belangrijkste stap in de procedure is vertegenwoordigd in een kleurgecodeerde stroomdiagram (Figuur 1). Zodra voltooid, moeten gebeitst embryo's haven een donkere paarse chromatische label in weefsel...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Visualisatie van de expressie van genen in embryonale Astyanax cavefish kunnen dit protocol. Deze aanpak is ontwikkeld met als doel het maximaliseren van gen expressie signaal, terwijl het minimaliseren van aspecifieke achtergrondkleuring.

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Ons in situ protocol is belangrijk omdat het een eenvoudige manier biedt om genexpressiepatronen te visualiseren met minimale achtergrondkleuring. Deze techniek maakt een ingewikkeld en langdurig protocol relatief eenvoudig uit te voeren. Benchtop set-up suggesties en checklists verstrekt maken dit protocol nog gemakkelijker om correct uit te voeren en te reproduceren.Terwijl de hier getoonde technieken specifiek voor Astyanax mexicanus is, zou het waarschijnlijk aan andere systemen van vergelijkbare grootte individuen met kleine aanpassingen aan het protocol kunnen worden aangepast. Gebruik eerst gekleurde labtape om flesjes en pipetten voor elk gen aan te wijzen. Sorteer met een Pasteur pipet de embryo's.Er zijn meestal niet meer dan 12 embryo's per flesje, eenmaal gesorteerd. Stel vervolgens een schuddend waterbad in op 70 graden Celsius. Trek de methanol voorzichtig uit in de flesjes van gesorteerde embryo's en vervang deze door 500 microliter verse 100% methanol.Was de embryo's kort voor ongeveer een minuut op een platform shaker. Rehydrateer hierna de embryo's in een toenemende concentratie van 1x PBS met Tween 20 op een platformshaker zoals beschreven in het tekstprotocol. Om te beginnen, plaats een kleine pakking met een gaas bodem in het roterende water bad dat is voorverwarmd tot 70 graden Celsius.Plaats aliquots van hybridisatie buffer minus en hybridisatie buffer plus in de pakking. Voeg voorzichtig een voorbereide PK-oplossing toe aan de flesjes embryo's die ervoor zorgen dat alle weefsels volledig in oplossing zijn bedekt. Breng de flesjes over op een platformshaker en laat ze ongeveer 12 minuten verteren in de eiwitase K werkoplossing.Trek hierna voorzichtig de PK-oplossing af en overspoel de flacon kort met PBT om de resterende PK te verdunnen. Vervang de PBT-oplossing door 500 microliters verse PBT en laat de oplossing vijf minuten op de platformshaker spoelen. Vervang vervolgens de PBT-oplossing door 500 microliters ontdooide 4%PFA. Laat de embryo's 20 minuten op het platform schudden bij kamertemperatuur.Om te beginnen pre-hybridisatie, voeg 500 microliters van voorverwarmde hybridisatie buffer minus oplossing aan de embryo-bevattende flacons. Plaats de flesjes voorzichtig in de pakking in het waterbad op 70 graden Celsius zonder vijf minuten te schudden. Trek vervolgens de hybridisatiebuffer minus-oplossing af en overspoel de flacons met 500 microliters van voorverwarmde hybridisatiebuffer plus oplossing.Plaats de flesjes terug in de pakking in het waterbad en uitbroeden met schudden, hetzij voor vier uur of 's nachts. Om te beginnen met hybridisatie, trek de hybridisatiebuffer plus uit de flacons en vervang deze door 500 microliters van verse voorverwarmde hybridisatiebuffer plus. Voeg voorzichtig twee microliters RNA-sonde toe aan elke flacon en wervel zachtjes om een gelijkmatige verdeling van de sonde te garanderen.Incubeer in het waterbad bij 70 graden Celsius 's nachts tijdens het schudden op 40 RPM. Om te beginnen, bereiden microcentrifuge buizen gelabeld hybridisatie buffer plus met het gen van belang RNA sonde zoals beschreven in het tekstprotocol. Stel twee 15-milliliter conische buizen en voeg 0,2 gram blokkerend reagens en 10 milliliter MABT.Plaats beide buizen op een geknerende mixer totdat het reagens volledig is opgelost in de oplossing. Met behulp van een glas Pasteur pipet trekken uit de hybridisatie buffer plus en sonde oplossing en plaats het in een steriele gelabelde microcentrifuge buis. Bewaar deze buis in de vriezer bij min 20 graden Celsius voor toekomstig gebruik.Voeg voorzichtig 500 microliter van de warme zoutoplossing natriumcitraat en hybridisatiebuffer minus verdunningen toe. Incubeer in opeenvolgende oplossingen gedurende 10 minuten elk in het schudden water bad, en vervolgens bij kamertemperatuur op een platform shaker zoals beschreven in het tekstprotocol. Vervang na de laatste incubatie de 100%PBT uit elke flacon door 500 microliters van MABT.Herhaal dit proces twee keer gedurende vijf minuten per stuk. Verwijder eerst de MABT uit elke flacon en overspoel deze met een voorgemengde blokkeeroplossing uit een van de conische buizen van 15 milliliter. Plaats beide flesjes vier uur lang op de gektenileerde mixer bij kamertemperatuur.Voeg twee microliter van de antilichaamfragmenten toe aan de tweede buis van voorbereide blokkerende oplossing en kort vortex. Vul vervolgens elke flacon bijna volledig met blokkerende oplossing en plaats ze 's nachts op een gekonnerende mixer in een koelkast bij vier graden Celsius. Om te beginnen, maak een voorraad flacon van 10%NGS in MABT.Vervang de blokkeringsoplossing in elke flacon door 500 microliter van deze NGS-oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur op het platform shaker gedurende 25 minuten. Vervang hierna het NGS-mengsel door 500 microliter van 100%MABT.Incubeer op het platform shaker bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Herhaal deze spoeling nog 11 keer gedurende de dag, elke 30 minuten. Vul vervolgens elke flacon met 100% MABT en leg ze 's nachts op een gekatleende mixer in een koelkast op vier graden Celsius.Vervang eerst de MABT in elke flacon door één milliliter AP-buffer en laat deze vijf minuten wassen. Herhaal deze was twee keer om de MABT volledig te verwijderen. Vervang vervolgens de AP-buffer door een milliliter verse AP-buffer met 3,5 microliter BCIP en 4,5 microliter MBT.Vervang dit door een vers mengsel van AP buffer met de BCIP en MBT elk uur totdat de reactie is voltooid, zorg ervoor dat de reactie nauwlettend te volgen en controleer elke 15 minuten totdat het gewenste niveau van vlekken is bereikt. Stop de kleurreactie door de embryo's te spoelen in een toenemende concentratie van 1X PBT in AP-buffer zoals beschreven in het protocol. Spoel de embryo's in ongeveer vijf milliliter van 100%PBT op een nootachtige mixer totdat de gewenste minimale achtergrondkleuring is bereikt.Wanneer de spoeling is voltooid, was de embryo's in 500 microliter van steriele PBS op een platform shaker en postfix de monsters zoals beschreven in het tekstprotocol. Na het spoelen van de embryo's, plaats ze in vier milliliter van 100% steriele PBS en indien nodig bewaar ze op lange termijn op vier graden Celsius. In deze studie worden embryonale Astyanax-specimens gelabeld voor hoogwaardige genexpressieanalyse.Dit proces is met succes geïmplementeerd in zowel Pachon cavefish als oppervlaktevisembryo's. Cavefish embryo's gelabeld voor Sox9 expressie tonen duidelijke etikettering in de zich ontwikkelende branchial bogen en borstvin. Merk op dat vlekken vrijwel afwezig zijn in de dooierzak of de zich ontwikkelende somites op de flank.Op dezelfde manier is Tfap2a-expressie duidelijk zichtbaar in de delen van het ontwikkelende hoofd als vroege migratie neurale kuifcellen langs het rugflankgebied van het embryo. Het derde gen gepresenteerd voor cavefish embryo's, Phf20a, wordt gezien in de delen van de somatische mesoderm en achterste hoofd die bestemd zijn om aanleiding te geven tot benige weefsel. Oppervlaktevisembryo's met het label CXCR vertonen een positieve etikettering in geïsoleerde gebieden van het hoofd en de flank, evenals een paar individuele cellen die de dooierzak bovenwaarts drijven.Het gen Adcyap1a wordt uitgedrukt in regio's van het centrale zenuwstelsel, waaronder hypofysecellen. Let op de zeer specifieke expressie in gepaarde bilaterale clusters van cellen op het dorsale aspect van het embryo, evenals een groter gebied van middellijnexpressie. Het laatste gen onderzocht op cavefish embryo's, Sox10, is duidelijk als een vroege marker van neurale kuif aan de linker- en rechterkant van het dorsale embryo.Na het voltooien in situ, we meestal beeld onze resultaten met behulp van lichte microscopie. Het is het beste om dit te doen binnen twee weken na voltooiing om afbraak van vlekken te voorkomen.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogene Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie voor het vergelijken van genexpressie Domeinen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualiseren van Multiciliated cellen in de zebravis via een gecombineerde Protocol van hele Mount fluorescentie In Situ hybridisatie en immunofluorescentie

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Met behulp van fluorescentie In Situ hybridisatie (FISH) te controleren van de toestand van Arm cohesie in Prometaphase en metafase ik Drosophila eicellen

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Whole-Mount In Situ Hybridisatie in Zebrafish Embryo's en Tube Formation Assay in iPSC-ECs om de rol van Endoglin in vasculaire ontwikkeling te bestuderen

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incrementele temperatuurveranderingen voor maximale fokkerij en spawning in Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...