Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire brut des commentaires utiles sur ce manuscrit. Nous tenons à souligner quatre lycéens qui utilise ce protocole au cours de stages d’été en 2017 et 2018, dont Christine Cao, Michael Warden, Aki Li et David Nwankwo. HL était soutenue par une bourse de recherche de souches de biologie UC pendant l’été de 2017. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DEB-1457630 de JBG) et le National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH ; DE025033 à JBG).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Cincinnati (protocole n° 10-01-21-01).
1. la fixation
<ol><li>Isoler le nombre désiré d’Astyanax mexicanus embryons provenant d’un réservoir d’élevage et difficulté ~ 50 embryons à la fois. Si les embryons sont grandes et anciennes, il peut être nécessaire de fixer les 25 à la fois pour assurer la fixation même.</li>
	<li>Selo...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

En raison de la vulnérabilité de l’ARN à la dégradation, une des étapes plus critiques dans le protocole porte sur la synthèse stérile de la sonde d’ARN. Toutefois, si une sonde est générée avec soin et donne de bons résultats, il peut être réutilisé dans des réactions subséquentes de coloration. Une seconde étape cruciale est la production minutieuse de tous les réactifs utilisés tout au long du protocole. Ce protocole implique plusieurs jours et nombreuses petites étapes, il est essentiel que to...

Hybridation in situ est une méthode commune pour la coloration des tissus fixés pour visualiser gene expression patterns1. Cette technique a été réalisée pour années dans d’autres traditionnels2 et systèmes de modèles non traditionnels3 , pour une variété d’études biologiques. Cependant, plusieurs étapes et les réactifs sont nécessaires pour réaliser avec succès cette procédure. Pour les enquêteurs qui n’ont jamais fait cette technique, il peut être intimidant en raison des nombreuses étapes d’amorcer le processus. En outre, la nature longue de cette procédure se prête à des fautes techniques, qui peuvent être difficile à résoudre.
L’objectif général du présent article est de présenter une méthode simple et directe qui rendra cette technique d’hybridation accessible à un large public. Afin de réduire l’introduction d’erreurs, nous présentons une approche simple qui donne expression de gène de haute qualité coloration et minimise le signal de fond non spécifique. Cette procédure est similaire aux autres approches développées dans les systèmes de modèle traditionnel, comme le Danio rerio4. Ici, nous visons à faciliter l’application minutieuse de chaque étape à l’aide d’une liste téléchargeable (fichier supplémentaire 1), à promouvoir l’application minutieuse du protocole. La raison d’être pour ce faire est de faciliter l’organisation à travers les nombreuses étapes dans cette procédure. Cet article est approprié pour les chercheurs intéressés dans l’accomplissement entier-montez l’hybridation in situ dans le développement des embryons, mais n’ont pas encore effectué la procédure. L’avantage de l’approche choisie pour Astyanax chercheurs est qu’il a été testé et prouvé en agassizii et morphes de poissons de surface, ce qui facilite les analyses comparatives d’expression. La méthode présentée peut être utilisée par des chercheurs en études sur les autres systèmes et Astyanax .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

Ces dernières années, un génome de projet pour les aveugles agassizii mexicain (Astyanax mexicanus) a été libéré, révéler l’identité de séquence pour des milliers de gènes. Des recherches antérieures dans ce nouveau système de modèle capitalisé sur les enquêtes de génome complets qui ont identifié plusieurs QTL (QTL) associé à divers phénotypes associés à la grotte. Toutefois, la possibilité de connecter des gènes d’intérêt à la base héréditaire de changement phénotypique demeure un défi important. Une technique qui peut faciliter une compréhension plus profonde du rôle du développement dans l’évolution de la troglomorphic est entier-montez l’hybridation in situ. Cette technique peut être implémentée pour directement comparer l’expression des gènes entre les formes vivant dans les grottes et surface, désigner candidat gènes qui sous-tendent les QTL établie, identifier des gènes d’intérêt provenant d’études de la nouvelle génération de séquençage ou développer autre approches axées sur la découverte. Dans ce rapport, nous présentons un protocole simple, accompagné d’une liste de contrôle flexible, qui peut être largement adapté pour une utilisation bien au-delà du système de l’étude présentée. Il est à espérer que ce protocole peut servir comme une grande ressource pour la communauté Astyanax et au-delà.

Dans ce rapport, nous proposons une approche simple et directe pour effectuer le marquage des spécimens d’Astyanax embryonnaires pour l’analyse de l’expression génique de haute qualité. Cette technique peut être effectuée dans les quatre ou cinq jours, et chaque étape principale de la procédure est représenté dans un diagramme de flux codés par couleur (Figure 1). Une fois terminé, embryons colorés devraient abriter une étiquette c...

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Ce protocole permet la visualisation de l’expression génique dans embryonnaires agassizii Astyanax . Cette approche a été développée avec l’objectif de maximiser le signal d’expression de gène, tout en minimisant la coloration de fond non spécifique.

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Notre protocole in situ est significatif parce qu’il fournit un moyen simple de visualiser les modèles d’expression des gènes avec un minimum de taches de fond. Cette technique rend un protocole compliqué et long relativement facile à exécuter. Benchtop a mis en place des suggestions et des listes de contrôle fournies rendre ce protocole encore plus facile à exécuter correctement et à reproduire.Bien que les techniques présentées ici soient spécifiques à Astyanax mexicanus, elles pourraient probablement être adaptées à d’autres systèmes d’individus de taille comparable avec de petits ajustements au protocole. Tout d’abord, utilisez du ruban de laboratoire coloré pour désigner des flacons et des pipettes pour chaque gène. À l’aide d’une pipette Pasteur, trier les embryons.Il n’y a généralement pas plus de 12 embryons par flacon, une fois triés. Ensuite, réglez un bain d’eau secouant à 70 degrés Celsius. Dessinez soigneusement le méthanol dans les flacons d’embryons triés et remplacez-le par 500 microlitres de méthanol frais à 100 %.Lavez brièvement les embryons pendant environ une minute sur un shaker de plate-forme. Après cela, réhydrater les embryons dans une concentration croissante de 1x PBS avec Tween 20 sur un shaker plate-forme tel que décrit dans le protocole de texte. Pour commencer, placez un petit joint avec un fond en maille dans le bain d’eau rotatif qui a été préchauffé à 70 degrés Celsius.Placez des aliquots de tampon d’hybridation moins et tampon d’hybridation plus dans le joint. Ajouter délicatement une solution pk préparée aux flacons d’embryons en veillant à ce que tous les tissus soient complètement recouverts de solution. Transférer les flacons dans un shaker de plate-forme et les laisser digérer dans la solution de travail proteinase K pendant environ 12 minutes.Après cela, retirez doucement la solution PK et inondez brièvement le flacon avec PBT pour diluer le PK restant. Remplacez la solution PBT par 500 microlitres de PBT frais et laissez la solution rincer sur le shaker de la plate-forme pendant cinq minutes. Remplacez ensuite la solution PBT par 500 microlitres de 4% PFA décongelés. Laissez les embryons couver sur le shaker de plate-forme à température ambiante pendant 20 minutes.Pour commencer la pré-hybridation, ajoutez 500 microlitres de tampon d’hybridation préchauré moins la solution aux flacons contenant de l’embryon. Placez soigneusement les flacons dans le joint dans le bain d’eau à 70 degrés Celsius sans trembler pendant cinq minutes. Ensuite, sortez du tampon d’hybridation moins la solution et inondez les flacons avec 500 microlitres de tampon d’hybridation préchauré plus la solution.Remettre les flacons dans le joint dans le bain d’eau et incuber en secouant pendant quatre heures ou toute la nuit. Pour commencer l’hybridation, tirez le tampon d’hybridation plus des flacons et remplacez-le par 500 microlitres de tampon d’hybridation préchaurmé frais plus. Ajouter soigneusement deux microlitres de sonde d’ARN à chaque flacon et tourbillonner doucement pour assurer une distribution uniforme de la sonde.Incuber dans le bain d’eau à 70 degrés Celsius pendant la nuit tout en secouant à 40 RPM. Pour commencer, préparez des tubes de microcentrifugeuse étiquetés tampon d’hybridation plus avec le gène d’intérêt sonde ARN tel que décrit dans le protocole de texte. Ensemble de deux tubes coniques de 15 millilitres et ajouter 0,2 grammes de réaccente de blocage et 10 millilitres de MABT.Placer les deux tubes sur un mélangeur à noix jusqu’à ce que le reagent soit complètement dissous dans la solution. À l’aide d’une pipette pasteur en verre, puisez le tampon d’hybridation et sondez la solution et placez-la dans un tube stérile de microcentrifugeuse étiqueté. Conservez ce tube dans le congélateur à moins 20 degrés Celsius pour une utilisation future.Ajouter délicatement 500 microlitres du citrate de sodium salin chaud et du tampon d’hybridation moins les dilutions. Incuber dans des solutions séquentielles pendant 10 minutes chacune dans le bain d’eau secouant, puis à température ambiante sur un shaker plate-forme tel que décrit dans le protocole texte. Après la dernière incubation, remplacer le 100% PBT de chaque flacon par 500 microlitres de MABT.Répétez ce processus deux fois pendant cinq minutes chacun. Tout d’abord, retirez le MABT de chaque flacon et inondez-le d’une solution de blocage préméxée de l’un des tubes coniques de 15 millilitres. Déposer les deux flacons sur le mélangeur à noix pendant quatre heures à température ambiante.Ajouter deux microlitres des fragments d’anticorps au deuxième tube de la solution de blocage préparée et brièvement vortex. Remplissez ensuite chaque flacon presque complètement avec la solution de blocage et placez-les sur un mélangeur de noix pendant la nuit dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Pour commencer, préparez un flacon d’actions de 10% NGS dans MABT.Remplacez la solution de blocage dans chaque flacon par 500 microlitres de cette solution NGS. Incuber à température ambiante sur le shaker de la plate-forme pendant 25 minutes. Après cela, remplacer le mélange NGS par 500 microlitres de 100%MABT.Incuber sur le shaker de plate-forme à température ambiante pendant 30 minutes. Répétez ce rinçage 11 fois de plus tout au long de la journée, toutes les 30 minutes. Remplissez ensuite chaque flacon de 100% MABT et placez-les sur un mélangeur à noix toute la nuit dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius.Tout d’abord, remplacez le MABT dans chaque flacon par un millilitre de tampon AP et laissez-le laver pendant cinq minutes. Répétez ce lavage deux fois pour enlever complètement le MABT. Remplacez ensuite le tampon AP par un millilitre de tampon AP frais contenant 3,5 microlitres de BCIP et 4,5 microlitres de MBT.Remplacez-le par un nouveau mélange de tampon AP contenant le BCIP et le MBT toutes les heures jusqu’à ce que la réaction soit terminée, en vous assurant de surveiller la réaction de près et de vérifier toutes les 15 minutes jusqu’à ce que le niveau désiré de coloration ait été atteint. Arrêtez la réaction de coloration en rinçant les embryons dans une concentration croissante de 1X PBT dans le tampon AP tel que décrit dans le protocole. Rincer les embryons en environ cinq millilitres de 100% PBT sur un mélangeur à noix jusqu’à ce que la coloration minimale désirée soit atteinte.Lorsque le rinçage est terminé, lavez les embryons en 500 microlitres de PBS stérile sur un shaker plate-forme et postfixez les spécimens tels que décrits dans le protocole de texte. Après le rinçage des embryons, placez-les en quatre millilitres de PBS 100% stérile et, si nécessaire, stockez-les à long terme à quatre degrés Celsius. Dans cette étude, les spécimens embryonnaires d’Astyanax sont étiquetés pour une analyse d’expression génétique de haute qualité.Ce processus a été mis en œuvre avec succès dans les embryons de poissons des cavernes pachon et de surface. Les embryons cavefish étiquetés pour l’expression Sox9 démontrent une étiquetage clair dans les arches branchiales en développement et la nageoire pectorale. Notez que la coloration est pratiquement absente dans le sac jaune ou les somites en développement sur le flanc.De même, l’expression tfap2a est évidente dans les parties de la tête en développement comme cellules de crête neuronale de migration précoce le long de la région dorsale de flanc de l’embryon. Le troisième gène présenté pour les embryons de poissons des cavernes, Phf20a, est observé dans les parties du mésoderm somatique et de la tête postérieure qui sont destinées à donner naissance à des tissus osseux. Les embryons de poissons de surface étiquetés pour le CXCR présentent un étiquetage positif dans les régions isolées de la tête et du flanc, ainsi que dans quelques cellules individuelles qui survolent le sac jaune.Le gène Adcyap1a est exprimé dans les régions du système nerveux central, y compris les cellules pituitaires. Notez l’expression très spécifique dans les grappes bilatérales jumelées de cellules sur l’aspect dorsale de l’embryon, ainsi qu’une plus grande région d’expression médiane. Le dernier gène examiné pour les embryons de poissons des cavernes, Sox10, est évident comme un marqueur précoce de la crête neurale sur les côtés gauche et droit de l’embryon dorsal.Après avoir terminé in situ, nous entons généralement nos résultats à l’aide d’une microscopie légère. Il est préférable de le faire dans les deux semaines suivant l’achèvement afin d’éviter la dégradation des taches.

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

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Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiser le nœud et la notochorde plaque en Gastrulating des embryons de souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage et toute monture Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Génotypage et quantification de l'hybridation in situ Taining in Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hybridation in situ à monture entière chez les embryons de poissons zèbres et l’essai de formation de tubes dans iPSC-ECs pour étudier le rôle de l’Endoglin dans le développement vasculaire

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Imagerie de calcium fluorescent et hybridation in situ subséquente pour la caractérisation neuronale de précurseur dans Les laevis de Xenopus

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Changements de température progressifs pour la reproduction et le frai maximaux chez Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...