Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
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Die Autoren möchte Mitglieder des Brutto-Labors für die hilfreichen Kommentare auf diesem Manuskript danken. Wir wollen vier Schülerinnen und Schüler zu würdigen, die dieses Protokoll während Sommerpraktika in 2017 und 2018, darunter Christine Cao, Michael Warden, Aki Li und David Nwankwo genutzt. HL wurde im Sommer 2017 durch ein UC-Biologie-STEM-Stipendium unterstützt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Foundation (DEB-1457630, JBG), National Institute of Dental und Craniofacial Forschung (NIH; DE025033, JBG).

Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Cincinnati (Protokoll Nr. 10-01-21-01) genehmigt.
1. Fixierung
<ol><li>Isolieren Sie gewünschte Anzahl von Astyanax Mexicanus Embryonen aus einem Zucht-Tank zu und beheben Sie ~ 50 Embryonen zu einem Zeitpunkt. Wenn Embryonen groß und alt sind, kann es 25 gleichzeitig auch Fixierung darauf festzulegen sein.</li>
	<li>Je nach Alter des Embryos nutzen Sie d...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

Aufgrund der Anfälligkeit der RNA zu einer Verschlechterung betrifft einer der wichtigsten Schritte im Protokoll die sterile Synthese der RNA-Sonde. Jedoch wenn eine Sonde sorgfältig erzeugt wird und gute Ergebnisse liefert, kann es in folgenden befleckenden Reaktionen wiederverwendet werden. Ein zweiter wichtiger Schritt ist die sorgfältige Herstellung der alle Reagenzien im gesamten Protokoll. Da dieses Protokoll mehrere Tage und viele kleine Schritte umfasst, ist es wichtig, dass alle Reagenzien genau produziert un...

In-situ Hybridisierung ist eine gängige Methode zur Färbung von festen Gewebe um gen-Expression-Muster1zu visualisieren. Diese Technik ist seit Jahren in anderen traditionellen2 und nicht-traditionellen3 -Modellsysteme, für eine Vielzahl von biologischen Studien durchgeführt. Allerdings sind mehrere Schritte und Reagenzien notwendig, um dieses Verfahren erfolgreich durchführen. Für Forscher, die diese Technik noch nie durchgeführt haben, kann es aufgrund der vielen Schritte einschüchternd sein, den Prozess zu initiieren. Weiter, die langwierige Natur dieses Verfahren eignet sich für technische Fehler, die schwierig sein können, um zu beheben.
Das übergeordnete Ziel dieses Artikels ist es, eine einfache und unkomplizierte Methode vorstellen, die diese Hybridisierung-Technik für ein breites Publikum zugänglich machen wird. Um die Einführung von Fehlern zu reduzieren, stellen wir eine einfache Lösung, die liefert hochwertige gen Ausdruck Färbung und unspezifische Hintergrundsignal minimiert. Dieses Verfahren ist ähnlich wie andere Ansätze, die in traditionellen Modellsysteme wie Danio Rerio4entwickelt. Wir wollen hier, sorgfältige Umsetzung der einzelnen Schritte anhand einer herunterladbaren Checkliste (ergänzende Datei 1), sorgfältige Durchführung des Protokolls zu fördern. Die Begründung hierfür ist Organisation durch die vielen Schritte in diesem Verfahren zu erleichtern. Dieser Artikel eignet sich für Forscher interessiert bei der Durchführung von in-situ Hybridisierung vollständig-hängen bei der Entwicklung von Embryonen, aber noch nicht das Verfahren durchgeführt. Der Vorteil des gewählten Ansatzes für Astyanax Forscher ist, dass es getestet wurde und in Cavefish und Oberfläche Fisch verwandelt, wodurch vergleichende Expressionsanalysen bewährt. Die vorgestellte Methode kann durch Forscher in Studien über Astyanax und anderen Systemen verwendet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

In den letzten Jahren wurde eine Entwurf Genom für die blinde mexikanischen Cavefish (Astyanax Mexicanus) freigegeben, enthüllt die Sequenz Identitäten für Tausende von Genen. Frühere Forschung in diesem aufstrebenden Modellsystem aktiviert auf umfassende genomweite Untersuchungen, die zahlreiche quantitative Trait Loci (QTL) verbunden mit verschiedenen Höhle verbundenen Phänotypen identifiziert haben. Die Möglichkeit, Gene von Interesse, die erbliche Grundlage für phänotypische Veränderung verbinden bleibt jedoch eine große Herausforderung dar. Eine Technik, die tieferes Verständnis für die Rolle der Entwicklung in der Troglomorphic Evolution erleichtern kann, ist vollständig-hängen in-situ-Hybridisierung. Diese Technik kann implementiert werden, um direkt vergleichen Genexpression zwischen Höhle und Oberfläche Wohnformen, Anwärter Gene zugrunde liegenden etablierten QTL, Gene Interesse von Next Generation Sequencing Studien zu identifizieren oder entwickeln andere Entdeckung-basierte Ansätze. In diesem Bericht stellen wir ein einfaches Protokoll, unterstützt durch eine flexible Checkliste, die für den Einsatz auch außerhalb des Studiensystems der vorgestellten weit angepasst werden kann. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll für die Astyanax Gemeinschaft und darüber hinaus als eine umfassende Ressource dienen kann.

In diesem Bericht stellen wir einen einfachen und unkomplizierten Ansatz zur Kennzeichnung von embryonalen Astyanax Exemplare für qualitativ hochwertige gen Expressionsanalyse durchführen. Diese Technik kann in vier oder fünf Tagen durchgeführt werden, und jeder wesentlichen Schritt im Verfahren ist in eine farbcodierte Flussdiagramm (Abbildung 1) vertreten. Einmal abgeschlossen, sollte gebeizt Embryonen ein dunkles Lila chromatische Label in Gew...

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Dieses Protokoll ermöglicht die Visualisierung der Genexpression in embryonalen Astyanax Cavefish. Dieser Ansatz wurde mit dem Ziel der Maximierung der gen-Expression-Signal, bei gleichzeitiger Minimierung der unspezifischen Hintergrundfärbung entwickelt.

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Unser In-situ-Protokoll ist wichtig, weil es eine einfache Möglichkeit bietet, Genexpressionsmuster mit minimaler Hintergrundfärbung zu visualisieren. Diese Technik macht ein kompliziertes und langwieriges Protokoll relativ einfach durchzuführen. Benchtop richtet Vorschläge und Checklisten ein, die dieses Protokoll noch einfacher machen, um richtig zu arbeiten und zu reproduzieren.Während die hier gezeigten Techniken spezifisch für Astyanax mexicanus sind, könnte es wahrscheinlich an andere Systeme vergleichbar großer Individuen mit kleinen Anpassungen des Protokolls angepasst werden. Verwenden Sie zunächst farbiges Laborband, um Fläschchen und Pipetten für jedes Gen zu bestimmen. Sortieren Sie die Embryonen mit einer Pasteur-Pipette.Es gibt in der Regel nicht mehr als 12 Embryonen pro Durchstechflasche, einmal sortiert. Als nächstes stellen Sie ein schüttelendes Wasserbad auf 70 Grad Celsius. Ziehen Sie das Methanol sorgfältig in die Fläschchen sortierter Embryonen und ersetzen Sie es durch 500 Mikroliter frisches 100%Methanol.Waschen Sie die Embryonen kurz für etwa eine Minute auf einem Plattform-Shaker. Danach rehydrieren Sie die Embryonen in einer zunehmenden Konzentration von 1x PBS mit Tween 20 auf einem Plattform-Shaker, wie im Textprotokoll beschrieben. Um zu beginnen, legen Sie eine kleine Dichtung mit einem Netzboden in das rotierende Wasserbad, das auf 70 Grad Celsius vorgewärmt wurde.Setzen Sie Aliquots von Hybridisierungspuffer minus und Hybridisierungspuffer plus in die Dichtung. Fügen Sie den Durchstechflaschen von Embryonen vorsichtig eine vorbereitete PK-Lösung hinzu, um sicherzustellen, dass alle Gewebe vollständig in Lösung abgedeckt sind. Übertragen Sie die Fläschchen auf einen Plattform-Shaker und lassen Sie sie in der Proteinase K Arbeitslösung für ca. 12 Minuten verdauen.Danach die PK-Lösung vorsichtig abziehen und die Durchstechflasche kurz mit PBT überfluten, um die restliche PK zu verdünnen. Ersetzen Sie die PBT-Lösung durch 500 Mikroliter frisches PBT und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang auf dem Plattform-Shaker abspülen. Dann ersetzen Sie die PBT-Lösung durch 500 Mikroliter aufgetaut4%PFA. Lassen Sie die Embryonen auf der Plattform schütteln bei Raumtemperatur für 20 Minuten.Um mit der Vorhybridisierung zu beginnen, fügen Sie den embryonalen Fläschchen 500 Mikroliter vorgewärmten Hybridisierungspuffer minus Lösung hinzu. Die Fläschchen vorsichtig in die Dichtung im Wasserbad bei 70 Grad Celsius legen, ohne fünf Minuten zu zittern. Als nächstes ziehen Sie den Hybridisierungspuffer minus Lösung ab und überfluten Sie die Fläschchen mit 500 Mikrolitervorwärmungspuffer plus Lösung.Legen Sie die Fläschchen wieder in die Dichtung im Wasserbad und bebrüten Sie vier Stunden oder über Nacht mit Schütteln. Um mit der Hybridisierung zu beginnen, ziehen Sie den Hybridisierungspuffer plus aus den Durchstechflaschen und ersetzen Sie ihn durch 500 Mikroliter frisch vorgewärmten Hybridisierungspuffer plus. Fügen Sie vorsichtig zwei Mikroliter RNA-Sonde zu jeder Durchstechflasche hinzu und wirbeln Sie vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Sonde zu gewährleisten.Inkubieren Sie im Wasserbad bei 70 Grad Celsius über Nacht, während sie bei 40 Umdrehungen um 40 Umdrehungen abschütteln. Zu Beginn bereiten Sie Mikrozentrifugenröhren mit der Bezeichnung Hybridisierungspuffer plus mit dem Gen von Interesse RNA-Sonde, wie im Textprotokoll beschrieben. Legen Sie zwei 15-Milliliter konische Schläuche und fügen Sie 0,2 Gramm blockierendes Reagenz und 10 Milliliter MABT hinzu.Legen Sie beide Schläuche auf einen Nutatmischer, bis das Reagenz vollständig in der Lösung gelöst ist. Mit einer gläsernen Pasteurpipette ziehen Sie den Hybridisierungspuffer plus und die Sondenlösung ab und legen Sie ihn in ein steriles, beschriftetes Mikrozentrifugenrohr. Bewahren Sie diese Röhre bei minus 20 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung im Gefrierschrank auf.500 Mikroliter des warmen saline Natriumcitrats und Hybridisierungspuffers minus Verdünnungen vorsichtig hinzufügen. Insekubieren Sie in sequenziellen Lösungen für jeweils 10 Minuten im schüttenden Wasserbad und dann bei Raumtemperatur auf einem Plattform-Shaker, wie im Textprotokoll beschrieben. Ersetzen Sie nach der letzten Inkubation die 100%PBT aus jeder Durchstechflasche durch 500 Mikroliter MABT.Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal für jeweils fünf Minuten. Entfernen Sie zunächst den MABT aus jeder Durchstechflasche und überfluten Sie ihn mit einer vorgemischten Blockierlösung aus einem der 15-Milliliter-Konusrohre. Legen Sie beide Fläschchen vier Stunden bei Raumtemperatur auf den Nutmischer.Fügen Sie zwei Mikroliter der Antikörperfragmente in die zweite Röhre der vorbereiteten Blockierlösung und kurz Wirbel. Dann jede Durchstechflasche fast vollständig mit Sperrlösung füllen und bei vier Grad Celsius über Nacht auf einen Nussmischer im Kühlschrank legen. Zu Beginn bereiten Sie eine Durchstechflasche mit 10%NGS in MABT vor.Ersetzen Sie die Blockierlösung in jeder Durchstechflasche durch 500 Mikroliter dieser NGS-Lösung. 25 Minuten bei Raumtemperatur auf dem Plattform-Shaker inkubieren. Danach die NGS-Mischung durch 500 Mikroliter 100%MABT ersetzen.Inkubieren Sie auf dem Plattform-Shaker bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Wiederholen Sie diese Spüle 11 weitere Male im Laufe des Tages, alle 30 Minuten. Dann jede Durchstechflasche mit 100%MABT füllen und bei vier Grad Celsius über Nacht auf einen Nussmischer im Kühlschrank stellen.Ersetzen Sie zunächst den MABT in jeder Durchstechflasche durch einen Milliliter AP-Puffer und lassen Sie ihn fünf Minuten waschen. Wiederholen Sie diese Wäsche zweimal, um den MABT vollständig zu entfernen. Ersetzen Sie dann den AP-Puffer durch einen Milliliter frischen AP-Puffer, der 3,5 Mikroliter BCIP und 4,5 Mikroliter MBT enthält.Ersetzen Sie dies durch eine frische Mischung aus AP-Puffer, der den BCIP und MBT jede Stunde enthält, bis die Reaktion abgeschlossen ist, und stellen Sie sicher, dass die Reaktion genau überwacht wird und alle 15 Minuten überprüft wird, bis der gewünschte Färbegrad erreicht ist. Beenden Sie die Färbungsreaktion, indem Sie die Embryonen in einer zunehmenden Konzentration von 1X PBT im AP-Puffer, wie im Protokoll beschrieben, spülen. Spülen Sie die Embryonen in etwa fünf Milliliter n.A. 100%PBT auf einem Nutatmischer, bis die gewünschte minimale Hintergrundfärbung erreicht ist.Wenn die Spülung abgeschlossen ist, waschen Sie die Embryonen in 500 Mikroliter sterilen PBS auf einem Plattform-Shaker und postfixieren Sie die Proben, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach dem Spülen der Embryonen in vier Milliliter 100% sterile PBS legen und bei Bedarf langfristig bei vier Grad Celsius lagern. In dieser Studie werden embryonale Astyanax-Proben für eine hochwertige Genexpressionsanalyse gekennzeichnet.Dieser Prozess wurde sowohl in Pachon-Höhlenfischen als auch in Oberflächenfischen erfolgreich umgesetzt. Höhlenfisch-Embryonen, die für den Sox9-Ausdruck gekennzeichnet sind, zeigen eine klare Kennzeichnung in den sich entwickelnden Zweigbögen und der Brustflosse. Beachten Sie, dass Färbung praktisch fehlt im Dottersack oder die sich entwickelnden Soden an der Flanke.In ähnlicher Weise ist die Tfap2a-Expression in den Teilen des sich entwickelnden Kopfes als frühe Migration neuronaler Kammzellen entlang der dorsalen Flankenregion des Embryos zu erkennen. Das dritte Gen, das für Höhlenfische embryonal präsentiert wird, Phf20a, ist in den Teilen des somatischen Mesoderms und des hinteren Kopfes zu sehen, die dazu bestimmt sind, knöchernes Gewebe hervorzurufen. Oberflächenfischembryonen, die für CXCR gekennzeichnet sind, zeigen eine positive Kennzeichnung in isolierten Bereichen des Kopfes und der Flanke sowie einige einzelne Zellen, die den Dottersack überlagern.Das Gen Adcyap1a wird in Regionen des zentralen Nervensystems einschließlich Hypophysenzellen exprimiert. Beachten Sie die hochspezifische Expression in gepaarten bilateralen Zellclustern auf den dorsalen Aspekt des Embryos sowie einen größeren Bereich der Mittellinienexpression. Das letzte Gen, das auf Höhlenfisch-Embryonen untersucht wurde, Sox10, ist als früher Marker des neuralen Kamms auf der linken und rechten Seite des dorsalen Embryos offensichtlich.Nach Abschluss in situ stellen wir uns unsere Ergebnisse in der Regel mit Hilfe der Lichtmikroskopie ab. Es ist am besten, dies innerhalb von zwei Wochen nach Abschluss zu tun, um eine Verschlechterung der Färbung zu vermeiden.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-Target-Chromogenic Whole-mount<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung zum Vergleich Genexpression Domains in<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryos

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

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Visualisierung von Multiciliated Zellen in der Zebrabärbling durch ein kombiniertes Protokoll der ganze Berg Leuchtstofflampen In Situ Hybridisierung und Immunfluoreszenz

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotypisierung und Quantifizierung der In-Situ-Hybridisierungsfärbung in Zebrafischen

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ganz-Mount-In-Situ-Hybridisierung in Zebrafisch-Embryonen und Tube-Formations-Assay in iPSC-ECs zur Untersuchung der Rolle von Endoglin in der Gefäßentwicklung

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluoreszierende Calcium-Bildgebung und anschließende In-Situ-Hybridisierung zur neuronalen Vorläufercharakterisierung bei Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Inkrementelle Temperaturänderungen für maximale Brut und Laichzeit bei Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...