Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

המחברים רוצים להודות חברי המעבדה ברוטו עבור הערות מועילות על כתב היד הזה. ברצוננו להודות ארבעה תלמידי תיכון אשר מנוצל פרוטוקול זה במהלך התמחות קיץ בחודשים 2017 2018, לרבות כריסטין סאו, מייקל וורדן, אקי Li נוואנקוו דוד. HL נתמכה על ידי מלגת UC ביולוגיה גזע במהלך קיץ 2017. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (דב-1457630 כדי JBG), נבחרת מוסדות של שיניים ואת ואסטתיים מחקר (NIH; DE025033 אל JBG).

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת סינסינטי (פרוטוקול #10-01-21-01).
1. קיבוע
<ol><li>לבודד את המספר הרצוי של Astyanax mexicanus עוברי מטנק הרבייה ותקן ~ 50 העוברים במועד. אם העוברים גדול וישן, ייתכן צורך לתקן 25 בכל פעם כדי להבטיח ק?...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

בשל הפגיעות של RNA כדי השפלה, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול נוגע הסינתזה סטרילי של החללית ה-RNA. עם זאת, אם בדיקה מופק היטב, מספק תוצאות טובות, זה יכול לעשות שימוש חוזר בתגובות מכתימים עוקבות. צעד מכריע השני הוא ייצור זהיר של כל ריאגנטים בשימוש בכל רחבי בפרוטוקול. מאז פרוטוקול זה כרוך מספ?...

היברידיזציה באתר היא שיטה נפוצה עבור צביעת רקמות קבוע להמחיש דפוסי ביטוי גנים1. טכניקה זו בוצעה שנים אחרים מסורתי2 שגרתיים3 דגם מערכות, למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים. עם זאת, מספר צעדים, ריאגנטים נחוצים לבצע הליך זה בהצלחה. עבור חוקרים אשר מעולם לא ביצע בטכניקה זו, מפעיל את התהליך יכולה להיות מאיימת בשל הצעדים רבים הכרוכים עוד יותר, מהות ההליך ממושך משאיל את עצמו על שגיאות טכניות, אשר עשויה להיות מאתגרת כדי לפתור בעיות.
המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג שיטה פשוטה שיעבד טכניקה זו הכלאה נגיש לקהל רחב. כדי לצמצם את המבוא של שגיאות, אנו מציגים בגישה ישירה התשואות באיכות גבוהה ג'ין ביטוי מכתים, ממזער את האות רקע שאינם ספציפיים. הליך זה דומה גישות אחרות שפותחה במערכות דגם מסורתיים, כגון רזבורה rerio4. כאן, אנו שואפים לקדם יישום זהיר של כל שלב באמצעות רשימת פעולות לביצוע להורדה (1 קובץ משלים), כדי לקדם את יישום זהיר של הפרוטוקול. הרציונל לביצוע פעולה זו היא להקל על הארגון בשלבים רבים הכרוכים בהליך זה. מאמר זה מתאים מהחוקרים המעוניינים בביצוע היברידיזציה כולה-הר בפיתוח עוברי, אך עדיין לא ביצעתי את ההליך. היתרון של הגישה שבחרת עבור חוקרים Astyanax הוא כי זה יש נבדק והוכח cavefish והן morphs דגים השטח, ובכך להקל ביטוי השוואתי ניתוחים. ניתן להשתמש בשיטת שהוצגו על ידי חוקרים מחקרים על Astyanax ומערכות אחרות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

בשנים האחרונות, גנום טיוטה עבור מקסיקני עיוור cavefish (Astyanax mexicanus) שוחררה, לחשוף את זהותם רצף אלפי גנים. מחקר קודם במערכת מודל המתעוררים הזאת באותיות רישיות על חקירות הגנום כולו מקיף זיהו אינספור אתרים תכונה כמותית כמותיים המשויך פנוטיפים שונים הקשורים המערה. עם זאת, היכולת להתחבר הגנים של ריבית הבסיס heritable לשינוי פנוטיפי נשאר אתגר משמעותי. טכניקה אחת זה יכול להקל על הבנה עמוקה יותר של התפקיד של פיתוח באבולוציה troglomorphic הוא היברידיזציה כולה-הר. ניתן ליישם טכניקה זו כדי להשוות בין גנים בין המערה - ואת משטח המגורים טפסים, למנות מועמד גנים שבבסיס QTL הוקמה, לזהות את הגנים של עניין ממחקרים הדור הבא רצפי או לפתח את זה ישירות גישות מבוססות-גילוי. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול פשוט, הנתמך על-ידי רשימת תיוג גמיש, אשר ניתן להתאים באופן נרחב לשימוש הרבה מעבר למערכת המחקר הציג. יש לקוות כי פרוטוקול זה יכול לשמש משאב רחבה למען הקהילה Astyanax ומעבר.

בדו ח זה, אנו מספקים גישה פשוטה וישירה לביצוע תיוג של דגימות Astyanax עובריים לניתוח ביטוי גנים איכותיים. טכניקה זו יכולה להתבצע או ארבעה או חמישה ימים, כל שלב העיקריות בהליך מיוצג בתרשים זרימה מקודדות לפי צבעים (איור 1). עם סיום, מוכתם עוברי צריך הנמל תווי?...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

פרוטוקול in situ שלנו הוא משמעותי כי הוא מספק דרך פשוטה לדמיין דפוסי ביטוי גנים עם כתמי רקע מינימליים. טכניקה זו הופכת פרוטוקול מסובך וממושך לקל יחסית לביצוע. Benchtop להגדיר הצעות ורשימות פעולות לביצוע בתנאי להפוך פרוטוקול זה אפילו קל יותר לבצע כראוי לשכפל.בעוד הטכניקות המוצגות כאן הוא ספציפי Astyanax mexicanus, זה יכול להיות מותאם למערכות אחרות של אנשים בגודל יחסית עם התאמות קטנות לפרוטוקול. ראשית, השתמש בקלטת מעבדה צבעונית כדי לייעד בקבוקונים ופיפטות עבור כל גן. באמצעות פיפטה פסטר, למיין את העוברים.בדרך כלל יש לא יותר מ 12 עוברים לכל בקבוקון, פעם מיון. לאחר מכן, להגדיר אמבט מים רועדים ל 70 מעלות צלזיוס. משוך בזהירות את המתנול בבקבוקונים של עוברים ממוינים, והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מתנול טרי של 100%.לשטוף את העוברים לזמן קצר במשך כדקה על שייקר פלטפורמה. לאחר מכן, rehydrate העוברים בריכוז הולך וגדל של 1x PBS עם Tween 20 על שייקר פלטפורמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל, מניחים אטם קטן עם תחתית רשת לתוך אמבט המים המסתובב שחומם מראש ל 70 מעלות צלזיוס.מניחים aliquots של חיץ הכלאה מינוס ומאגר הכלאה בתוספת לתוך אטם. הוסיפו בעדינות פתרון PK מוכן לבקבוקונים של עוברים המבטיחים שכל הרקמות מכוסות לחלוטין בתסיסה. מעבירים את הבקבוקונים לשייקר פלטפורמה ותנו להם לעכל את פתרון העבודה של proteinase K במשך כ-12 דקות.לאחר מכן, משוך בעדינות את פתרון ה- PK והציף בקצרה את הבקבוקון ב- PBT כדי לדלל את ה- PK הנותר. החלף את פתרון PBT עם 500 microliters של PBT טרי ולתת את הפתרון לשטוף על שייקר פלטפורמה במשך חמש דקות. לאחר מכן החלף את פתרון PBT ב-500 מיקרוליטרים של 4%PFA מופשרים. תן לעוברים דגירה על שייקר הרציף בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.כדי להתחיל בהכלאה מראש, הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ הכלאה טרום המלחמה מינוס פתרון לבקבוקונים המכילים עוברים. בזהירות למקם את הבקבוקונים לתוך אטם באמבט המים ב 70 מעלות צלזיוס מבלי לרעוד במשך חמש דקות. הבא למשוך את חיץ ההכלאה מינוס פתרון להציף את הבקבוקונים עם 500 microliters של מאגר הכלאה מראש המלחמה בתוספת פתרון.מניחים את הבקבוקונים בחזרה לתוך אטם באמבט המים דגירה עם רועד או במשך ארבע שעות או לילה. כדי להתחיל בהכלאה, משוך את מאגר ההכלאה פלוס מתוך הבקבוקונים והחלף אותו ב-500 מיקרוליטרים של מאגר הכלאה טרי לפני המלחמה פלוס. בזהירות להוסיף שני microliters של בדיקה RNA לכל בקבוקון בעדינות מערבולת כדי להבטיח הפצה שווה של החללית.דגירה באמבט המים ב 70 מעלות צלזיוס לילה תוך כדי רעידות ב 40 סל"ד. כדי להתחיל, להכין צינורות microcentrifuge שכותרתו מאגר הכלאה פלוס עם הגן של בדיקה RNA עניין כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הגדר שני צינורות חרוט 15 מיליליטר ולהוסיף 0.2 גרם של reagent חסימה ו 10 מיליליטר של MABT.מניחים את שני הצינורות על מערבל אגוזים עד שהריג'נט מומס לחלוטין בתמיסה. באמצעות פיפטה פסטר זכוכית לצייר את חיץ הכלאה פלוס פתרון בדיקה ולמקום אותו לתוך צינור microcentrifuge סטרילי שכותרתו. אחסן צינור זה במקפיא במינוס 20 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי.בזהירות להוסיף 500 microliters של ציטראט נתרן מלוחים חמים חיץ הכלאה מינוס דילול. דגירה בפתרונות רציפים במשך 10 דקות כל אחד באמבט המים הרועדים, ולאחר מכן בטמפרטורת החדר על שייקר פלטפורמה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הדגירה האחרונה, החלף את ה- PBT של 100% מכל בקבוקון ב- 500 מיקרוליטרים של MABT.חזור על תהליך זה פעמיים במשך חמש דקות כל אחד. ראשית, להסיר את MABT מכל בקבוקון ולהציף אותו עם פתרון חסימה premixed מאחד צינורות חרוט 15 מיליליטר. מניחים את שני הבקבוקונים על מערבל האגוזים במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.מוסיפים שני מיקרוליטרים של שברי הנוגדנים לצינור השני של פתרון חסימה מוכן ומערבולת לזמן קצר. לאחר מכן ממלאים כל בקבוקון כמעט לחלוטין בתווית חסימה ומכניסים אותם על מערבל אגוזים לילה במקרר בארבע מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, להכין בקבוקון מניות של 10%NGS ב MABT.החלף את פתרון החסימה בכל בקבוקון ב- 500 מיקרוליטרים של פתרון NGS זה. דגירה בטמפרטורת החדר על שייקר הרציף במשך 25 דקות. לאחר מכן, החלף את תערובת ה- NGS ב- 500 מיקרוליטרים של 100% MABT.דגירה על שייקר פלטפורמה בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. חזור על שטיפה זו 11 פעמים נוספות לאורך כל היום, כל 30 דקות. לאחר מכן ממלאים כל בקבוקון ב-100% MABT ומכניסים אותו למיקסר אגוזי לילה במקרר ב-4 מעלות צלזיוס.ראשית, החלף את MABT בכל בקבוקון עם מיליליטר אחד של חיץ AP ולתת לו לשטוף במשך חמש דקות. חזור על שטיפה זו פעמיים כדי להסיר לחלוטין את MABT. לאחר מכן החלף את מאגר AP במיליליטר אחד של מאגר AP טרי המכיל 3.5 מיקרוליטר של BCIP ו- 4.5 מיקרוליטר של MBT.החלף זאת בתערובת טרייה של מאגר AP המכיל את BCIP ו- MBT כל שעה עד להשלמת התגובה, הקפד לעקוב מקרוב אחר התגובה ולבדוק כל 15 דקות עד לרמת הכתמים הרצויה. עצור את תגובת הצבע על ידי שטיפת העוברים בריכוז הולך וגדל של PBT 1X במאגר AP כמתואר בפרוטוקול. שוטפים את העוברים בכ-5 מיליליטר של 100%PBT על מערבל אגוזים עד להכתמת הרקע המינימלית הרצויה.כאשר השטיפה הושלמה, לשטוף את העוברים ב 500 microliters של PBS סטרילי על שייקר פלטפורמה ו postfix הדגימות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר שטיפה העוברים, מניחים אותם בארבעה מיליליטר של 100% PBS סטרילי ואם יש צורך לאחסן אותם לטווח ארוך בארבע מעלות צלזיוס. במחקר זה דגימות Astyanax עובריות מסומנות לניתוח ביטוי גנים באיכות גבוהה.תהליך זה יושם בהצלחה הן בעוברים של דגי מערות פקון והן בעוברים של דגי שטח. עוברי דגי מערות המסומן בביטוי Sox9 מדגימים תיוג ברור בקשתות הענפיות המתפתחות ובסנפיר החזה. שים לב כי הכתמים נעדרים כמעט בוואק החלמון או בסומיטים המתפתחים באגף.באופן דומה, ביטוי Tfap2a ניכר בחלקים של הראש המתפתח כמו תאים סמל עצבי הגירה מוקדמת לאורך אזור האגף הגבי של העובר. הגן השלישי המוצג לעוברים של דגי מערות, Phf20a, נראה בחלקים של מסודרם סומטי וראש אחורי שנועדו ללדת רקמה גרמית. עוברי דג פני השטח המסווים ב- CXCR מראים תיוג חיובי באזורים מבודדים של הראש והאגף, כמו גם כמה תאים בודדים המגזים בשי החלמון.הגן Adcyap1a בא לידי ביטוי באזורים של מערכת העצבים המרכזית כולל תאי יותרת המוח. שים לב לביטוי הספציפי ביותר באשכולות דו-צדדיים משויך של תאים בהיבט הגבי של העובר, כמו גם אזור גדול יותר של ביטוי קו האמצע. הגן האחרון שנבדק לעוברים של דגי מערות, Sox10, ניכר כסמן מוקדם של סמל עצבי בצד שמאל וימין של העובר הגבי.לאחר השלמת situ, אנחנו בדרך כלל תמונה התוצאות שלנו באמצעות מיקרוסקופ אור. עדיף לעשות זאת בתוך שבועיים לאחר השלמת על מנת למנוע השפלה של כתמים.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

הבנת organogenesis המוקדם שימוש פשוטה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאת פרוטוקול ב<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

להמחיש Multiciliated בתאים דג זברה באמצעות פרוטוקול משולב של פלורסנט הר שלמה בחיי עיר הכלאה, Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

כתמים וכימות של היברידיזציה באתרו בתוך דג זברה

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

הר שלם בתוך היברידיזציה ב-Zebrafish עוברים ושיטת היווצרות צינור ב-iPSC-ECs ללמוד את התפקיד של אנגלין בפיתוח כלי דם

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

שינויי טמפרטורה מצטברים לרבייה מקסימלית והשריצה באסטיאנקס מקסיקו

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...