Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
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Gli autori desiderano ringraziare i membri del laboratorio lordo per utili commenti su questo manoscritto. Vogliamo riconoscere quattro studenti delle scuole superiori che hanno utilizzato questo protocollo durante stage estivi nel 2017 e 2018, tra cui Christine Cao, Michael Warden, Aki Li e David Nwankwo. HL è stato sostenuto da una borsa di studio UC biologia staminali durante l'estate del 2017. Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della National Science Foundation (DEB-1457630 a JBG) e il National Institutes of Dental e Craniofacial Research (NIH; DE025033 a JBG).

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Cincinnati (protocollo n. 10-01-21-01).
1. fissazione
<ol><li>Isolare il numero desiderato di Astyanax mexicanus embrioni da un serbatoio di allevamento e difficoltà ~ 50 embrioni alla volta. Se gli embrioni sono grandi e vecchi, può essere necessario fissare 25 alla volta per garantire anche fissazione.</li>
	<li>A seconda dell'età dell'embrione, utilizzare...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

A causa della vulnerabilità di RNA alla degradazione, una delle fasi più critiche nel protocollo riguarda la sintesi sterile della sonda RNA. Tuttavia, se una sonda è generata con attenzione e fornisce buoni risultati, può essere riutilizzato nelle successive reazioni di colorazione. Un secondo punto cruciale è la produzione accurata di tutti i reattivi utilizzati in tutto il protocollo. Poiché questo protocollo coinvolge diversi giorni e molti piccoli passi, è essenziale che tutti i reagenti sono accuratamente pr...

L'ibridazione in situ è un metodo comune per la colorazione di tessuti fissi per visualizzare gene expression pattern1. Questa tecnica è stata eseguita per anni in altri tradizionali2 e sistemi di modello non tradizionali3 , per una varietà di studi biologici. Tuttavia, diversi passi e reagenti sono necessari per eseguire correttamente questa procedura. Per i ricercatori che non hanno mai eseguito questa tecnica, dando inizio al processo può essere intimidatorio a causa i molti passaggi. Ulteriormente, la natura lunga di questa procedura si presta ad errori tecnici, che possono essere difficile da risolvere.
L'obiettivo generale di questo articolo è di presentare un metodo semplice e diretto che renderà accessibile ad un vasto pubblico questa tecnica di ibridazione. Per ridurre l'introduzione di errori, vi presentiamo un approccio diretto che produce alta qualità gene espressione macchiatura e riduce al minimo segnale di fondo non specifici. Questa procedura è simile ad altri approcci sviluppati in sistemi modello tradizionale, come Danio rerio4. Qui, ci proponiamo di facilitare l'implementazione attenta di ogni passo usando una lista scaricabile (Supplemental File 1), per promuovere attenzione l'attuazione del protocollo. La spiegazione razionale per questa operazione è quello di facilitare organizzazione attraverso i molti passaggi di questa procedura. Questo articolo è adatto per i ricercatori interessati a condurre l'ibridazione in situ del intero-supporto nello sviluppo di embrioni, ma non hanno ancora eseguito la procedura. Il vantaggio dell'approccio scelto per i ricercatori Astyanax è che è stato testato e dimostrato in caverna e superficie pesce morph, facilitando in tal modo l'analisi dell'espressione comparativa. Il metodo presentato può essere utilizzato dai ricercatori negli studi su Astyanax e altri sistemi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

Negli ultimi anni, è stato rilasciato un genoma di bozza per la caverna cieca messicano (Astyanax mexicanus), rivelando l'identità di sequenza per migliaia di geni. Ricerca priore in questo sistema modello emergente capitalizzati sulle indagini di genoma complete che hanno identificato numerosi loci di carattere ereditario quantitativo (QTL) associati con vari fenotipi di grotta-collegata. Tuttavia, la capacità di connettersi alla base ereditabile per cambiamento fenotipico di geni di interesse rimane una sfida significativa. Una tecnica che può facilitare la comprensione più profonda del ruolo di sviluppo in troglomorfiche evoluzione è intero-monta l'ibridazione in situ. Questa tecnica può essere implementata per confrontare l'espressione genica tra forme e superficie-caverne, nominare candidato geni alla base di QTL stabilito, identificare geni di interesse dagli studi di sequenziamento di nuova generazione o sviluppare altri direttamente approcci basati sulla scoperta. In questo rapporto, presentiamo un protocollo semplice, supportato da una lista di controllo flessibile, che può essere ampiamente adattato per l'uso ben oltre il sistema di studio presentato. Si spera che questo protocollo può servire come una vasta risorsa per la comunità di Astianatte e oltre.

In questo rapporto, forniamo un approccio semplice e diretto per eseguire etichettatura delle embrionali Astyanax campioni per analisi di espressione genica di alta qualità. Questa tecnica può essere effettuata in quattro o cinque giorni, e ogni passaggio principale della procedura è rappresentata in un diagramma di flusso con codifica a colori (Figura 1). Una volta completato, macchiati embrioni dovrebbero harbor un'etichetta cromatica viola scur...

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Questo protocollo permette la visualizzazione dell'espressione genica in embrionali Astyanax caverna. Questo approccio è stato sviluppato con l'obiettivo di massimizzare il segnale di espressione genica, riducendo al minimo una colorazione di fondo non specifici.

Wholemount ibridazione In Situ per gli embrioni Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Il nostro protocollo in situ è significativo perché fornisce un modo semplice per visualizzare i modelli di espressione genica con una colorazione minima dello sfondo. Questa tecnica rende un protocollo complicato e lungo relativamente facile da eseguire. I suggerimenti e le liste di controllo forniti rendono questo protocollo ancora più facile da eseguire correttamente e riprodurre.Mentre le tecniche qui mostrate sono specifiche di Astyanax mexicanus, potrebbero probabilmente essere adattate ad altri sistemi di individui di dimensioni comparabili con piccoli aggiustamenti al protocollo. Per prima cosa, usa il nastro da laboratorio colorato per designare fiale e pipette per ogni gene. Usando una pipetta Pasteur, ordina gli embrioni.Di solito non ci sono più di 12 embrioni per flaconcino, una volta ordinati. Quindi, imposta un bagno d'acqua tremante a 70 gradi Celsius. Estraggono con cura il metanolo nelle fiale degli embrioni selezionati e lo sostituiscono con 500 microlitri di metanolo fresco al 100%.Lavare brevemente gli embrioni per circa un minuto su uno shaker della piattaforma. Successivamente, reidratare gli embrioni in una crescente concentrazione di 1x PBS con Tween 20 su uno shaker di piattaforma come delineato nel protocollo di testo. Per iniziare, posizionare una piccola guarnizione con un fondo a rete nel bagno d'acqua rotante che è stato preriscaldato a 70 gradi Celsius.Inserire le aliquote del buffer di ibridazione meno e il buffer di ibridazione più nella guarnizione. Aggiungere delicatamente una soluzione di PK preparata alle fiale degli embrioni assicurando che tutti i tessuti siano completamente coperti in soluzione. Trasferire i flaconcini su uno shaker a piattaforma e lasciarli digerire nella soluzione di lavoro proteinasi K per circa 12 minuti.Successivamente, estraggono delicatamente la soluzione PK e inondano brevemente il flaconcino con PBT per diluire la chiave di piattaforma rimanente. Sostituire la soluzione PBT con 500 microlitri di PBT fresco e lasciare risciacquare la soluzione sullo shaker della piattaforma per cinque minuti. Sostituire quindi la soluzione PBT con 500 microlitri di PFA scongelato al 4%. Lasciare che gli embrioni incubano sullo shaker della piattaforma a temperatura ambiente per 20 minuti.Per iniziare la pre-ibridazione, aggiungere 500 microlitri di tampone di ibridazione prebellico meno la soluzione alle fiale contenenti embrioni. Posizionare con cura le fiale nella guarnizione nel bagno d'acqua a 70 gradi Celsius senza tremare per cinque minuti. Quindi estraggono il buffer di ibridazione meno la soluzione e inondano i flaconcini con 500 microlitri di buffer di ibridazione prebellico più soluzione.Riposizionare le fiale nella guarnizione nel bagno d'acqua e incubare con tremori per quattro ore o durante la notte. Per iniziare l'ibridazione, disegnare il buffer di ibridazione più dalle fiale e sostituirlo con 500 microlitri di nuovo buffer di ibridazione prebellico plus. Aggiungere con cura due microlitri di sonda RNA a ciascuna fiala e ruotare delicatamente per garantire una distribuzione uniforme della sonda.Incubare nel bagno d'acqua a 70 gradi Celsius durante la notte mentre si trema a 40 giri/min. Per iniziare, preparare tubi di microcentrifugo etichettati buffer di ibridazione più con il gene di interesse sonda RNA come delineato nel protocollo di testo. Impostare due tubi conici da 15 millilitri e aggiungere 0,2 grammi di reagente bloccante e 10 millilitri di MABT.Posizionare entrambi i tubi su un miscelatore di nutating fino a quando il reagente non viene completamente sciolto nella soluzione. Utilizzando una pipetta Pasteur in vetro estraggono il tampone di ibridazione più e sonda la soluzione e la posizionano in un tubo di microcentrifugo etichettato sterile. Conservare questo tubo nel congelatore a meno 20 gradi Celsius per un uso futuro.Aggiungere con cura 500 microlitri del citrato di sodio salino caldo e del tampone di ibridazione meno diluizioni. Incubare in soluzioni sequenziali per 10 minuti ciascuna nel bagno d'acqua tremante, quindi a temperatura ambiente su uno shaker della piattaforma come delineato nel protocollo di testo. Dopo l'ultima incubazione, sostituire il 100%PBT da ogni flaconcino con 500 microlitri di MABT.Ripetere questo processo due volte per cinque minuti ciascuno. In primo luogo, rimuovere il MABT da ogni flaconcino e inondarlo di soluzione di blocco premiscelata da uno dei tubi conici da 15 millilitri. Posizionare entrambe le fiale sul miscelatore di nutating per quattro ore a temperatura ambiente.Aggiungere due microlitri dei frammenti di anticorpo al secondo tubo di soluzione di blocco preparata e brevemente vortice. Quindi riempire ogni fiala quasi completamente con soluzione di blocco e posizionarle su un miscelatore di nutating durante la notte in frigorifero a quattro gradi Celsius. Per iniziare, preparare una fiala stock del 10%NGS in MABT.Sostituire la soluzione di blocco in ogni flaconcino con 500 microlitri di questa soluzione NGS. Incubare a temperatura ambiente sullo shaker della piattaforma per 25 minuti. Successivamente, sostituire la miscela NGS con 500 microlitri del 100%MABT.Incubare sullo shaker della piattaforma a temperatura ambiente per 30 minuti. Ripetere questo risciacquo altre 11 volte durante il giorno, ogni 30 minuti. Quindi riempire ogni fiala con 100%MABT e posizionarli su un mixer di nutating durante la notte in frigorifero a quattro gradi Celsius.In primo luogo, sostituire il MABT in ogni flaconcino con un millilitro di tampone AP e lasciarlo lavare per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio due volte per rimuovere completamente il MABT. Sostituire quindi il buffer AP con un millilitro di tampone PA fresco contenente 3,5 microlitri di BCIP e 4,5 microlitri di MBT.Sostituirlo con una nuova miscela di tampone AP contenente il BCIP e l'MBT ogni ora fino al completamento della reazione, assicurandosi di monitorare attentamente la reazione e controllare ogni 15 minuti fino a raggiungere il livello desiderato di colorazione. Interrompere la reazione di colorazione risciacquando gli embrioni in una concentrazione crescente di 1X PBT nel buffer AP come delineato nel protocollo. Risciacquare gli embrioni in circa cinque millilitri di 100%PBT su un miscelatore di nutating fino a raggiungere la colorazione minima di fondo desiderata.Al termine del risciacquo, lavare gli embrioni in 500 microlitri di PBS sterile su uno shaker a piattaforma e postfissare i campioni come delineato nel protocollo di testo. Dopo aver risciacquato gli embrioni, posizionarli in quattro millilitri di PBS sterile al 100% e, se necessario, conservarli a lungo termine a quattro gradi Celsius. In questo studio i campioni embrionali di Astyanax sono etichettati per l'analisi dell'espressione genica di alta qualità.Questo processo è stato implementato con successo sia nel pesce grotta pachon che negli embrioni di pesce di superficie. Gli embrioni di pesce grotta etichettati per l'espressione Sox9 dimostrano un'etichettatura chiara negli archi branchiali in via di sviluppo e nella pinna pettorale. Si noti che la colorazione è praticamente assente nel sacco vitellino o nei somiti in via di sviluppo sul fianco.Allo stesso modo, l'espressione di Tfap2a è evidente nelle porzioni della testa in via di sviluppo come cellule della cresta neurale di migrazione precoce lungo la regione del fianco dorsale dell'embrione. Il terzo gene presentato per gli embrioni di pesce grotta, Phf20a, è visto nelle porzioni del mesoderma somatico e della testa posteriore che sono destinate a dare origine a tessuto osseo. Gli embrioni di pesce di superficie etichettati per CXCR mostrano un'etichettatura positiva in regioni isolate della testa e del fianco, così come alcune singole cellule che sovrascrivano il sacco del tuorlo.Il gene Adcyap1a è espresso nelle regioni del sistema nervoso centrale comprese le cellule ipofisarie. Si noti l'espressione altamente specifica in ammassi bilaterali accoppiati di cellule sull'aspetto dorsale dell'embrione, così come una regione più ampia di espressione della linea mediana. L'ultimo gene esaminato per gli embrioni di pesce grotta, Sox10, è evidente come un primo marcatore della cresta neurale sui lati sinistro e destro dell'embrione dorsale.Dopo aver completato in situ, in genere immaginiamo i nostri risultati utilizzando la microscopia a luce. È meglio farlo entro due settimane dal completamento per evitare il degrado della colorazione.

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

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Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

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Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizzare il nodo e la piastra Notochordal In embrioni di topo Gastrulating mediante microscopia elettronica a scansione e intero Monte immunofluorescenza

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipizzazione e quantificazione della colorazione dell'ibridazione in situ nel pesce zebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Variazioni incrementali di temperatura per l'allevamento massimo e la deposizione delle uova in Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...