Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
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저자가이 원고에 도움이 의견에 대 한 총 연구소의 회원을 감사 하 고 싶습니다. 4 고 등 학생 들은 여름 인턴쉽 2017, 2018, 크리스틴 카오, 마이클 소장, 아키 리, 데이비드 은완코 등 동안이 프로토콜을 활용 하 길. HL은 UC 생물학 줄기 친목 2017의 여름 동안에 지원 됩니다. 이 작품은 국립 과학 재단 (뎁-1457630 JBG에), 그리고 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (NIH;에서 교부 금에 의해 지원 되었다 JBG에 DE025033)입니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학 신시내티 (프로토콜 #10-01-21-01)에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. 고정
<ol><li>번 식 탱크에서 Astyanax mexicanus 배아의 원하는 번호를 분리 하 고 한 번에 ~ 50 배아를 수정. 태아는 크고 오래 된, 경우 25도 고정 되도록 한 번에 해결 하기 위해 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>태아의 나이 따라 마 취의 I...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

저하로 RNA의 취약점 때문 프로토콜의 가장 중요 한 단계 중 하나는 RNA 조사 살 균 합성을 염려 한다. 그러나, 경우는 조사 신중 하 게 생성 되 고 좋은 결과 제공 합니다, 그것은 이후의 착 반응에 활용할 수 있습니다. 두 번째 중요 한 단계는 프로토콜에서 사용 하는 모든 시 약의 주의 생산 이다. 이 프로토콜 포함 하므로 몇 일 및 많은 작은 단계, 그것은 필수적인 모든 시 약은 정확 하 게, 생산과 ?...

제자리 교 잡 착 고정된 조직 유전자 표현 패턴1을 시각화 하는 일반적인 방법입니다. 이 기술은 다양 한 생물 학적 연구에 대 한 다른 전통적인2 및 비 전통적인3 모델 시스템에서 년간 수행 되었습니다. 그러나, 여러 단계 및 시 약은이 절차를 성공적으로 수행 하는 데 필요한. 결코이 방법을 수행한 조사 과정을 시작 될 수 있습니다 많은 단계 때문에 협박. 또한,이 절차의 긴 자연에 빌려준다 기술적인 오류를 해결 하기 어려울 수 있습니다.
이 글의 전반적인 목표는이 교 잡 기술은 다양 한 연령층에 접근할 수 렌더링 하는 간단 하 고 간단한 방법을 제시. 오류에 대 한 소개를 줄이기 위해, 선물이 고품질 유전자 식 얼룩 및 일반적인 배경 신호를 최소화 하는 간단한 접근. 이 절차는 다른 접근 Danio rerio4와 같은 전통적인 모델 시스템에서 개발 유사 합니다. 여기, 우리는 프로토콜의 주의 구현할 다운로드 점검 (보충 파일 1)를 사용 하 여 각 단계의 주의 구현 촉진을 목표로 합니다. 이 일에 대 한 근거가이 절차에 관련 된 여러 단계를 통해 조직 촉진 것입니다. 이 문서 전체 마운트 제자리 교 잡 배아 개발 수행에 관심이 있는 연구자에 적합 하지만 아직 절차 수행 하지. Astyanax 연구에 대 한 선택된 방법의 장점은 것 그것이 테스트 되 고 cavefish에 따라서 비교 식 분석을 촉진 하는 표면 물고기 변경해 입증. Astyanax 및 다른 시스템에 대 한 연구에서 연구자에 의해 제시 메서드를 사용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

최근 몇 년 동안에서 맹인 멕시코 cavefish (Astyanax mexicanus)에 대 한 초안 게놈이 나왔다, 유전자의 수천의 시퀀스 id를 공개. 이 신흥 모델 시스템에 대 한 사전 연구는 다양 한 동굴 관련 고기와 관련 된 수많은 양적 특성 loci (QTL) 식별 포괄적인 게놈 넓은 조사에 대문자. 그러나, phenotypic 변화에 대 한 상속 기초에 관심사의 유전자를 연결할 수는 중요 한 도전 남아 있습니다. Troglomorphic 진화에서 개발의 역할의 더 깊은 이해를 촉진 수 있는 하나의 기술은 전체 마운트 제자리 교 잡 이다. 이 기술은 직접 동굴 및 표면 주거 형태 사이의 유전자 발현을 비교, 지명 후보 유전자 설립된 QTL 기본, 다음-세대 시퀀싱 연구에서 유전자 식별 또는 다른 개발을 구현할 수 있다 검색 기반 접근입니다. 이 보고서에서 우리는 널리 제시 연구 시스템을 넘어 잘 사용 하기 위해 적용할 수 있는 유연한 검사 목록에서 지 원하는 간단한 프로토콜을 제시. 그것은 기대 Astyanax 지역 사회를 넘어이 프로토콜 광범위 한 자원으로 사용할 수 있습니다.

이 보고서에서 우리는 높은-품질 유전자 표정 분석에 대 한 미 발달 Astyanax 표본의 라벨 수행 하는 단순 하 고 간단 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 4 개 또는 5 일에 실시 될 수 있습니다 하 고 절차의 각 주요 단계 색된 순서도 (그림 1)에 표시 됩니다. 완료 되 면, 얼룩진된 배아 관심사의 특정 유전자를 표현 하는 조직에서 어두운 자주색 ?...

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

이 프로토콜에는 배아 Astyanax cavefish에 유전자 발현의 시각화 수 있습니다. 이 방법은 일반적인 배경 얼룩을 최소화 하면서 진 식 신호를 극대화 하는 목적으로 개발 되었습니다.

Wholemount Astyanax 배아에 대 한 제자리 교 잡

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

당사의 시투 프로토콜은 최소한의 배경 염색으로 유전자 발현 패턴을 시각화하는 간단한 방법을 제공하기 때문에 중요합니다. 이 기술을 사용하면 복잡하고 긴 프로토콜을 비교적 쉽게 수행할 수 있습니다. Benchtop은 제공된 제안 및 체크리스트를 설정하여 이 프로토콜을 올바르게 수행하고 재현하기가 더욱 쉬워졌습니다.여기에 표시된 기술은 Astyanax 멕시코인에 만연하지만 프로토콜을 조금씩 조정하는 비교적 크기의 개인의 다른 시스템에 적응 할 수 있습니다. 첫째, 각 유전자에 대한 바이알과 파이펫을 지정하기 위해 컬러 실험실 테이프를 사용합니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 배아를 정렬합니다.일반적으로 바이알 당 12 배아, 한 번 정렬 되지 않습니다. 다음으로 흔들리는 수조를 섭씨 70도까지 설정합니다. 정렬된 배아의 바이알에 메탄올을 조심스럽게 꺼내 신선한 100% 메탄올 500 마이크로리터로 대체하십시오.플랫폼 셰이커에서 약 1분 동안 배아를 잠깐 씻으시다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플랫폼 셰이커에 Tween 20을 가진 1x PBS의 증가 된 농도에서 배아를 재수화하십시오. 먼저 메쉬 바닥이 있는 작은 개스킷을 섭씨 70도까지 예열된 회전수 욕조에 놓습니다.혼성화 버퍼 마이너스 및 혼성화 버퍼의 알리쿼트와 개스킷에 넣습니다. 모든 조직이 용액으로 완전히 덮여 있는지 확인하는 배아 의 바이알에 준비된 PK 솔루션을 부드럽게 추가합니다. 바이알을 플랫폼 셰이커로 옮기고 단백질Ae K 작업 용액에서 약 12분 동안 소화하게 하십시오.그 후 PK 용액을 부드럽게 뽑아 내고 PBT로 바이알을 잠깐 범람하여 나머지 PK를 희석시합니다. PBT 솔루션을 500마이크로리터의 신선한 PBT로 교체하고 5분 동안 플랫폼 셰이커에 용액이 헹구도록 합니다. 그런 다음 PBT 솔루션을 해동 된 4 % PFA의 500 마이크로 리터로 대체하십시오. 배아가 실온에서 플랫폼 셰이커에 20분 동안 배아를 배양하게 하십시오.사전 혼성화를 시작하려면, 배아 함유 바이알에 미리 따뜻해지는 혼성화 완충액 마이너스 용액의 500마이크로리터를 추가한다. 조심스럽게 5 분 동안 흔들리지 않고 70섭씨에 수조에 개스킷에 바이알을 배치합니다. 다음으로 혼성화 버퍼 마이너스 솔루션을 빼고 500 마이크로리터의 미리 웜된 혼성화 버퍼 플러스 솔루션으로 바이알을 범람시합니다.바이알을 수조의 개스킷에 다시 넣고 4시간 또는 하룻밤 동안 흔들어 서배양합니다. 혼성화를 시작하려면 하이브리드화 버퍼를 바이알에서 빼내고 500마이크로리터의 신선한 미리 따뜻힌 혼성화 버퍼 플러스로 바꿉니다. 각 유리병에 RNA 프로브의 마이크로리터 2개를 조심스럽게 추가하고 부드럽게 소용돌이어 프로브의 분포를 보장합니다.40 RPM에서 흔들면서 하룻밤 사이에 70도의 수조에서 배양하십시오. 시작하려면, 마이크로 원심 분리구를 텍스트 프로토콜에 설명한 대로 관심 RNA 프로브의 유전자와 플러스 혼성화 버퍼로 라벨을 붙인 마이크로 원심 분리관을 준비한다. 두 개의 15 밀리 리터 원콘 튜브를 설정하고 차단 시약의 0.2 그램과 MABT의 10 밀리리터를 추가합니다.시약이 용액에 완전히 용해 될 때까지 두 튜브를 누두 믹서에 놓습니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 혼성화 버퍼 플러스 및 프로브 용액을 빼내고 멸균 라벨이 부착된 미세 센심분리기 튜브에 넣습니다. 이 튜브를 냉동실에 보관하여 영하 20도의 냉동고에 보관하여 향후 사용시 사용합니다.조심스럽게 디플루언스를 뺀 희석제의 따뜻한 식염수 나트륨 및 혼성화 버퍼의 500 마이크로리터를 추가합니다. 흔들리는 수조에서 각각 10분 동안 순차적인 솔루션을 인큐베이션한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플랫폼 셰이커의 실온에서 배양합니다. 마지막 인큐베이션 후 각 바이알에서 100% PBT를 MABT의 500 마이크로리터로 교체하십시오.이 과정을 각각 5분 동안 두 번 반복합니다. 먼저 각 유리병에서 MABT를 제거하고 15밀리리터 원뿔형 튜브 중 하나에서 미리 혼합된 차단 용액으로 범람하십시오. 양유리를 양수 믹서에 4시간 동안 실온에서 놓습니다.준비된 차단 용액의 두 번째 튜브에 항체 조각의 마이크로리터 2개를 추가하고 잠시 소용돌이를 냅니다. 그런 다음 각 유리병을 블로킹 용액으로 거의 완전히 채우고 섭씨 4도의 냉장고에 하룻밤 동안 누두믹서에 놓습니다. 시작하려면 MABT에서 10 % NGS의 주식 바이알을 준비하십시오.각 유리병의 차단 솔루션을 이 NGS 솔루션의 500 마이크로리터로 교체합니다. 플랫폼 셰이커의 실온에서 25분 동안 배양합니다. 그 후 NGS 혼합물을 100%MABT의 500 마이크로리터로 교체하십시오.실온에서 플랫폼 셰이커를 30분 동안 배양합니다. 이 헹구는 것을 하루 종일 11 번, 30 분마다 반복하십시오. 그런 다음 각 유리병을 100 % MABT로 채우고 섭씨 4도의 냉장고에 하룻밤 동안 누두믹서에 놓습니다.먼저 각 유리병의 MABT를 AP 버퍼 1밀리리터로 교체하고 5분간 세척합니다. 이 세척을 두 번 반복하여 MABT를 완전히 제거하십시오. 그런 다음 AP 버퍼를 BCIP 3.5 마이크로리터와 MBT의 4.5 마이크로리터를 포함하는 신선한 AP 버퍼 1밀리리터로 교체합니다.반응이 완료될 때까지 매시간 BCIP 및 MBT를 포함하는 AP 버퍼의 신선한 혼합물로 교체하여 반응을 면밀히 모니터링하고 원하는 수준의 염색이 이루어질 때까지 15분마다 확인하십시오. 프로토콜에 설명된 바와 같이 AP 버퍼에서 1X PBT의 농도가 증가함에 따라 배아를 헹구어 착색 반응을 중단한다. 원하는 최소 배경 염색에 도달할 때까지 영양가 믹서에 100% PBT의 약 5밀리리터에서 배아를 헹구는다.헹구는 것이 완료되면 플랫폼 셰이커에 멸균 PBS 500 마이크로리터로 배아를 세척하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 표본을 후지합니다. 배아를 헹구고 100% 멸균 PBS의 4밀리리터에 배치하고 필요한 경우 섭씨 4도에서 장기 보관하십시오. 이 연구에서 배아 Astyanax 표본은 고품질 유전자 발현 분석을 위해 표지됩니다.이 과정은 파촌 동굴물고기와 표면 물고기 배아 모두에서 성공적으로 구현되었습니다. Sox9 발현에 표지된 Cavefish 배아는 개발 된 분기 아치와 가슴 지느러미에서 명확한 라벨을 보여줍니다. 노른자 낭이나 측면의 개발 중인 솜트에는 얼룩이 거의 없습니다.유사하게, Tfap2a 발현은 배아의 등쪽 측면 영역을 따라 조기 이주 신경 문장 세포로서 개발 헤드의 부분에서 분명하다. 동굴 배아인 Phf20a를 위해 제시된 세 번째 유전자는 뼈 조직을 야기할 운명인 체세포 중구및 후방 머리의 부분에서 보입니다. CXCR에 표지된 표면 물고기 배아는 머리와 측면의 고립된 부위뿐만 아니라 노른자 낭을 덮치는 몇몇 개별 세포에서 양성 라벨을 표시합니다.유전자 Adcyap1a는 뇌하수체 세포를 포함하는 중추 신경계의 영역에서 발현된다. 배아의 등쪽 양상에 있는 세포의 쌍쌍 양측 클러스터에 있는 높게 특정한 발현, 뿐만 아니라 중간선 발현의 더 큰 지구에 주의하십시오. 동굴 배아를 위해 검토된 마지막 유전자인 Sox10은 등쪽 배아의 왼쪽과 오른쪽에 있는 신경 문장의 초기 마커로서 분명합니다.시투에서 완료 한 후, 우리는 일반적으로 가벼운 현미경 을 사용하여 결과를 이미지. 염색의 저하를 피하기 위해 완료 후 2 주 이내에이 작업을 수행하는 것이 가장 좋습니다.

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Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

이해 간체를 사용하여 초기 형성기<em&gt; 현장에서</em에서&gt; 하이브리드 프로토콜<em&gt; 아프리카 발톱 개구리</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

연구

발생학

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

멀티 타겟 원체 전체 마운트<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드에서 유전자 발현의 도메인을 비교<em&gt; 초파리</em&gt; 배아

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Multiciliated 셀 전체 마운트 형광 제자리에서 교 잡 및 면역 형광의 결합 된 프로토콜을 통해 Zebrafish에 시각화

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Prometaphase 팔 응집력과 분열의 상태를 모니터링 하려면 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 나 초파리 Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

제브라피시의 인시투 혼성화 염색의 게놈 및 정량화

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

혈관 발달에서 엔도글린의 역할을 연구하기 위해 iPSC-ECs의 제브라피시 배아 및 튜브 형성 분석에서 시투 혼성화에 대한 전체 마운트

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

제노푸스 라에비스의 신경 전구체 특성화를 위한 형광 칼슘 이미징 및 후속 시토 혼성화

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

아스티야낙스 멕시코인의 막시달 번식과 산란에 대한 증분 온도 변화

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...