Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke medlemmer av brutto lab for nyttige kommentarer på dette manuskriptet. Vi ønsker å erkjenne fire high school-elever som utnyttet denne protokollen under Sommer praksisplasser i 2017 og 2018, inkludert Christine Cao, Michael Warden, Aki Li og David Nwankwo. HL ble støttet av en UC biologi STEM Fellowship sommeren 2017. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Science Foundation (DEB-1457630 til JBG), og den nasjonale institutter for Dental og Craniofacial forskning (NIH; DE025033 til JBG).

Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av University of Cincinnati (Protocol #10-01-21-01).
1. fiksering
<ol><li>Finne ønsket antall Astyanax mexicanus embryoer fra en formering tank og løse ~ 50 embryo samtidig. Hvis embryoer er store og gamle, kan det være nødvendig å fikse 25 for å sikre selv fiksering.</li>
	<li>Avhengig av alderen på fosteret, bruker du metoden IACUC godkjent av anestesi. For eldre embryoer...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

På grunn av sikkerhetsproblemet av til fornedrelse gjelder en av de viktigste trinnene i protokollen sterilt syntesen av RNA sonden. Men hvis en sonde genereres nøye, og gir gode resultater, kan det bli gjenbrukt i påfølgende flekker reaksjoner. Andre avgjørende trinnet er forsiktig produksjon av reagenser brukes i protokollen. Siden denne protokollen innebærer flere dager og mange små skritt, er det viktig at alle reagenser er nøyaktig produsert og lagret i et sterilt måte. Videre, det er fundamentalt viktig at...

In situ hybridisering er en vanlig måte flekker fast vev for å visualisere gene expression mønstre1. Denne teknikken er utført i år i andre tradisjonelle2 og utradisjonelle3 modellsystemer, for en rekke biologiske studier. Flere trinn og reagenser er imidlertid nødvendig for å utføre denne prosedyren. For etterforskere som aldri har utført denne teknikken, kan starte prosessen være skremmende på grunn av mange trinnene involvert. Videre gir lange natur denne prosedyren seg til tekniske feil, som kan være utfordrende for å feilsøke.
Det overordnede målet med denne artikkelen er å presentere en enkel og grei metode som gjør denne hybridisering teknikken tilgjengelig for et bredt publikum. For å redusere innføring av feil, presenterer vi en enkel tilnærming som gir høy kvalitet gene expression flekker og minimerer uspesifisert bakgrunn signal. Denne fremgangsmåten ligner andre tilnærminger utviklet i tradisjonelle modellsystemer, for eksempel Danio rerio4. Her, forsøker vi å rette forsiktig gjennomføring av hvert trinn bruker en nedlastbar Sjekkliste (ekstra fil 1), å fremme forsiktig gjennomføring av protokollen. Begrunnelsen for dette er å lette organisasjon gjennom mange trinnene involvert i denne prosedyren. Denne artikkelen er hensiktsmessig for forskere interessert i å utføre hele-mount i situ hybridisering utvikle embryo, men ennå ikke har utført fremgangsmåten. Fordelen av valgte tilnærming for Astyanax forskere er at det har blitt testet og utprøvd i både cavefish og overflate fisk morphs, dermed tilrettelegge sammenlignende uttrykk analyser. Presentert metoden kan brukes av forskere i studier på Astyanax og andre systemer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

De siste årene, er et utkast genom for det blind meksikanske cavefish (Astyanax mexicanus) blitt befridd, avslørende sekvens identiteter for tusenvis av gener. Tidligere forskning i denne nye modellsystem kapitalisert på omfattende genomet hele undersøkelser som har identifisert flere kvantitative egenskap loci (QTL) forbundet med ulike hule-assosiert fenotyper. Muligheten til å koble gener rundt til arvelig grunnlaget for fenotypiske endringen imidlertid en betydelig utfordring. En teknikk som kan gjøre dypere forståelse av rollen i utviklingen i troglomorphic evolution er hele-mount i situ hybridisering. Denne teknikken kan implementeres direkte sammenligne genuttrykk mellom hule - og overflaten-bolig former, nominere kandidat gener underliggende etablerte QTL, identifisere tilblivelse interesse fra neste generasjons sekvensering studier eller utvikle andre Discovery-baserte tilnærminger. I denne rapporten presenterer vi en enkel protokoll, støttet av en fleksibel Sjekkliste, som kan være mye tilpasset for bruk godt utover presentert studie systemet. Håpet er at denne protokollen kan tjene som en bred ressurs for Astyanax samfunnet og utover.

I denne rapporten gir vi en enkel og grei tilnærming for å utføre merking av embryonale Astyanax for høy kvalitet gene expression analyse. Denne teknikken kan utføres enten fire eller fem dager, og hvert viktigste trinn i prosedyren er representert i et fargekodet flytskjema (figur 1). En gang fullført, bør farget embryo havn en mørk lilla kromatisk etikett i vev uttrykke det bestemte genet av interesse. Vi har implementert denne protokollen ...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Denne protokollen kan visualisering av byggkorn under embryonale Astyanax cavefish. Denne tilnærmingen har blitt utviklet med mål om å maksimere gene expression signal, samtidig som ikke-spesifikke bakgrunnen flekker.

Wholemount i Situ hybridisering for Astyanax embryo

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Vår in situ-protokoll er viktig fordi den gir en enkel måte å visualisere genuttrykksmønstre med minimal bakgrunnsfarging. Denne teknikken gjør en komplisert og langvarig protokoll relativt enkel å utføre. Benkeplate oppsett forslag og sjekklister gitt gjøre denne protokollen enda enklere å utføre riktig og reprodusere.Mens teknikkene som vises her er spesifikke for Astyanax mexicanus, kan det sannsynligvis tilpasses andre systemer av sammenlignbare størrelse individer med små justeringer av protokollen. Bruk først farget laboratorietape til å utpeke hetteglass og pipetter for hvert gen. Bruk en Pasteur pipette, sortere embryoene.Det er vanligvis ikke mer enn 12 embryoer per hetteglass, når sortert. Deretter setter du et ristingsvannbad til 70 grader Celsius. Trekk forsiktig ut metanol i hetteglassene med sorterte embryoer, og erstatt den med 500 mikroliter friskt 100% metanol.Vask embryoene kort i omtrent ett minutt på en plattformshaker. Etter dette rehydrerer embryoene i en økende konsentrasjon av 1x PBS med Tween 20 på en plattformshaker som beskrevet i tekstprotokollen. Til å begynne med, legg en liten pakning med en nettingbunn i det roterende vannbadet som er forvarmet til 70 grader Celsius.Plasser aliquots av hybridisering buffer minus og hybridisering buffer pluss i pakningen. Tilsett forsiktig en forberedt PK-løsning på hetteglassene med embryoer som sikrer at alle vev er helt dekket av oppløsning. Overfør hetteglassene til en plattform shaker og la dem fordøye i proteinase K arbeidsløsning i ca 12 minutter.Etter dette trekker du forsiktig av PK-oppløsningen og oversvømmer hetteglasset med PBT for å fortynne gjenværende PK. Bytt UT PBT-oppløsningen med 500 mikroliter frisk PBT og la oppløsningen skylle på plattformshakeren i fem minutter. Bytt deretter PBT-løsningen med 500 mikroliter tint 4%PFA. La embryoene inkubere på plattformen shaker ved romtemperatur i 20 minutter.For å begynne pre-hybridisering, legg til 500 mikroliter med prewarmed hybridisering buffer minus løsning til embryoholdige hetteglass. Legg hetteglassene forsiktig i pakningen i vannbadet ved 70 grader Celsius uten å riste i fem minutter. Deretter trekker hybridisering buffer minus løsning og flom hetteglass med 500 mikroliter med prewarmed hybridisering buffer pluss løsning.Plasser hetteglassene tilbake i pakningen i vannbadet og inkuber med risting enten i fire timer eller over natten. For å begynne hybridisering, trekk hybridiseringsbufferen pluss ut av hetteglassene og bytt den ut med 500 mikroliter med fersk førkrigsd hybridiseringsbuffer pluss. Tilsett forsiktig to mikroliter RNA-sonde til hvert hetteglass og virvle forsiktig for å sikre jevn fordeling av sonden.Inkuber i vannbadet ved 70 grader Celsius over natten mens du rister på 40 RPM. Til å begynne med, forberede mikrocentrifuge rør merket hybridisering buffer pluss med genet av interesse RNA sonde som beskrevet i tekstprotokollen. Sett ut to koniske rør på 15 milliliter og tilsett 0,2 gram blokkerende reagens og 10 milliliter MABT.Plasser begge rørene på en nøttemikser til reagensen er fullstendig oppløst i oppløsningen. Bruk en pasteurpipette i glass, og trekk av hybridiseringsbufferen pluss og sondeløsning og plasser den i et sterilt merket mikrocentrifugerør. Oppbevar dette røret i fryseren ved minus 20 grader Celsius for fremtidig bruk.Tilsett forsiktig 500 mikroliter av den varme saltvannsnatriumsitraten og hybridiseringsbufferen minus fortynninger. Inkuber i sekvensielle løsninger i 10 minutter hver i det ristende vannbadet, og deretter ved romtemperatur på en plattformshaker som beskrevet i tekstprotokollen. Etter siste inkubasjon erstatter du 100 % PBT fra hvert hetteglass med 500 mikroliter MABT.Gjenta denne prosessen to ganger i fem minutter hver. Fjern først MABT fra hvert hetteglass og oversvømmer det med forhåndsblitt blokkeringsløsning fra et av de 15 milliliter koniske rørene. Plasser begge hetteglassene på nutating mikseren i fire timer ved romtemperatur.Tilsett to mikroliter av antistofffragmentene til det andre røret med forberedt blokkeringsløsning og kort virvel. Fyll deretter hvert hetteglass nesten helt med blokkerende løsning og legg dem på en nøttemikser over natten i kjøleskap ved fire grader Celsius. For å begynne, forberede et lager hetteglass med 10% NGS i MABT.Bytt blokkeringsoppløsningen i hvert hetteglass med 500 mikroliter av denne NGS-oppløsningen. Inkuber ved romtemperatur på plattformshakeren i 25 minutter. Etter dette erstatter du NGS-blandingen med 500 mikroliter på 100 % MABT.Inkuber på plattformen shaker ved romtemperatur i 30 minutter. Gjenta denne skyllen 11 ganger til i løpet av dagen, hvert 30. Fyll deretter hvert hetteglass med 100% MABT og legg dem på en nøttemikser over natten i kjøleskap ved fire grader Celsius.Først må du erstatte MABT i hvert hetteglass med én milliliter AP-buffer og la det vaske i fem minutter. Gjenta denne vasken to ganger for å fjerne MABT helt. Deretter erstatter du AP-bufferen med én milliliter fersk AP-buffer som inneholder 3,5 mikroliter BCIP og 4,5 mikroliter MBT.Erstatt dette med en ny blanding av AP-buffer som inneholder BCIP og MBT hver time til reaksjonen er fullført, og sørg for å overvåke reaksjonen nøye og kontroller hvert 15. Stopp fargereaksjonen ved å skylle embryoene i en økende konsentrasjon på 1X PBT i AP-buffer som beskrevet i protokollen. Skyll embryoene i ca. fem milliliter på 100 % PBT på en nøttemikser til ønsket minimum bakgrunnsfarging er nådd.Når skyllingen er fullført, vask embryoene i 500 mikroliter steril PBS på en plattformshaker og postfix prøvene som beskrevet i tekstprotokollen. Etter skylling av embryoene, legg dem i fire milliliter på 100% steril PBS og om nødvendig lagre dem langsiktig ved fire grader Celsius. I denne studien er embryonale Astyanax-prøver merket for genuttrykksanalyse av høy kvalitet.Denne prosessen er implementert med hell i både Pachon hulefisk og overflatefisk embryoer. Hulefisk embryoer merket for Sox9 uttrykk demonstrere klar merking i de utviklende branchial buer og pectoral finne. Legg merke til at farging er praktisk talt fraværende i eggeplommeseken eller de utviklende somites på flanken.På samme måte er Tfap2a-uttrykket tydelig i delene av det utviklende hodet som tidlig migrasjon nevrale crestceller langs det dorsale flankeområdet til embryoet. Det tredje genet presentert for hulefisk embryoer, Phf20a, er sett i deler av det somatiske mesoderm og bakre hodet som er bestemt til å gi opphav til benete vev. Overflatefiskembryoer merket for CXCR viser positiv merking i isolerte områder av hodet og flanken, samt noen få individuelle celler som ligger over eggeplommeseken.Genet Adcyap1a uttrykkes i regioner i sentralnervesystemet, inkludert hypofyseceller. Legg merke til det svært spesifikke uttrykket i sammenslåtte bilaterale klynger av celler på det dorsale aspektet av embryoet, samt et større område av midtlinjeuttrykk. Det siste genet som undersøkes for hulefiskembryoer, Sox10, er tydelig som en tidlig markør for nevrale kam på venstre og høyre side av dorsal embryoet.Etter å ha fullført in situ, ser vi vanligvis resultatene våre ved hjelp av lett mikroskopi. Det er best å gjøre dette innen to uker etter ferdigstillelse for å unngå nedbrytning av farging.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Forstå Tidlig organogenesis hjelp av en forenklet<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering Protocol i<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering for Sammenligning av genekspresjon domener i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoet

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisere Multiciliated celler i sebrafisk gjennom kombinert protokollen hele Mount fluorescerende In Situ hybridisering og Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Bruk fluorescens In Situ hybridisering (fisk) å overvåke tilstanden til Arm samhold i Prometaphase og Metaphase jeg Drosophila Oocytes

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotyping og kvantifisering av In Situ Hybridisering Farging i Sebrafisk

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmontering i Situ Hybridisering i sebrafisk embryoer og tube formasjonsanalyse i iPSC-ECs å studere rollen som Endoglin i vaskulær utvikling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerende kalsiumavbildning og påfølgende in Situ hybridisering for nevronal forløper karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Trinnvise temperaturendringer for maksimal avl og gyting i Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...