Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить членов брутто лаборатории за полезные замечания по этой рукописи. Мы хотим отметить четыре учащихся средней школы, которые использовали этот протокол во время летней стажировки в 2017 и 2018, включая Christine Цао, Майкл Уорден, Аки Li и Дэвид Нванкво. HL поддержал UC биологии стволовых стипендий в течение лета 2017. Эта работа была поддержана субсидии от национального научного фонда (DEB-1457630 до JBG) и национальные институты стоматологических и челюстно-лицевой исследований (низ; DE025033 для JBG).

Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из Университета Цинциннати (протокол #10-01-21-01).
1. Фиксация
<ol><li>Изолировать желаемое количество эмбрионов Астианакт гракл от разведения танк и исправить ~ 50 эмбрио...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

Ввиду уязвимости РНК к деградации одним из наиболее важных шагов в протокол касается стерильных синтез РНК зонда. Однако если зонд тщательно создается и дает хорошие результаты, то могут использоваться в последующих реакций окрашивания. Вторым важным шагом является тщательное произв?...

Гибридизации in situ является распространенным методом для окрашивания фиксированных тканей для визуализации ген выражение модели1. Эта техника была выполнена для лет в других традиционных2 и нетрадиционных3 модели систем, для различных биологических исследований. Однако несколько шагов и реактивы необходимы для успешного выполнения этой процедуры. Для следователей, которые никогда не выполнили эту технику инициирование процесса может быть пугающим из-за многих этапов. Кроме того длительный характер этой процедуры поддается технические ошибки, которые могут быть сложным для устранения неполадок.
Общая цель этой статьи заключается в простой и прямой метод, который будет отображать этот гибридизации метод доступным для широкой аудитории. Чтобы уменьшить введение ошибок, мы представляем простой подход, который дает высокое качество ген выражение окрашивание и минимизирует неспецифической фонового сигнала. Эта процедура похожа на другие подходы, разработанные в традиционной модели систем, таких как данио рерио4. Здесь мы стремимся содействовать тщательного выполнения каждого шага, используя загружаемый контрольный (дополнительный файл 1), для содействия тщательного осуществления протокола. Обоснование этого заключается в содействии Организации через многие этапы этой процедуры. Эта статья подходит для исследователей, заинтересованных в выполнении всего гора гибридизации in situ в развивающихся эмбрионов, но пока еще не выполнили процедуру. Преимущество выбранного подхода для Астианакт исследователей является, что он было проверено и доказано в cavefish и поверхности рыбы морф, способствуя тем самым сравнительного выражения анализа. Представленный метод может использоваться исследователями в исследованиях по Астианакт и других систем.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

В последние годы были освобождены проект генома для слепых мексиканской cavefish (Астианакт гракл), выявление последовательности идентификаторов для тысяч генов. Предыдущие исследования в этой формирующейся системе модель капитализируются на комплексные исследования генома общесистемной, которые выявили многочисленные локусов количественных признаков (QTL) связанные с различных связанных пещера фенотипов. Однако возможность подключения гены интереса к наследственным основы для фенотипические изменения остается серьезной проблемой. Один из методов, которые могут способствовать более глубокое понимание роли развития в эволюции troglomorphic — целое гора в гибридизации situ. Этот метод может быть реализован для непосредственно сравнить экспрессии генов между формами и поверхности местонахождения троглофильных, кандидата генов, лежащие в основе созданной QTL, идентифицировать гены интереса от следующего поколения последовательности исследований или разрабатывать другие подходы, основанные на открытие. В настоящем докладе мы представляем простой протокол, поддерживаемый гибкие контрольный список, который может быть широко адаптирована для использования далеко за рамки представленного исследования системы. Остается надеяться, что этот протокол может служить широкий ресурс для Астианакт сообщества и за его пределами.

В настоящем докладе мы предоставляем простой и прямой подход для выполнения маркировки эмбриональных Астианакт образцов для анализа выражения гена высокого качества. Эта техника может осуществляться в четыре или пять дней, и каждый основной шаг в процедуре пред...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Этот протокол позволяет визуализации экспрессии генов в эмбриональных Астианакт cavefish. Этот подход был разработан с целью максимального сигнала выражения гена, минимизируя фон неспецифичный пятнать.

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Наш протокол in situ имеет важное значение, поскольку он обеспечивает простой способ визуализации моделей экспрессии генов с минимальным фоном окрашивания. Этот метод делает сложный и длительный протокол относительно простым в работе. Бенчтоп создал предложения и контрольные списки, которые делают этот протокол еще проще для правильного выполнения и воспроизведения.Хотя методы, показанные здесь, специфичны для Astyanax mexicanus, они, вероятно, могут быть адаптированы к другим системам лиц сопоставимого размера с небольшими корректировками протокола. Во-первых, используйте цветную лабораторную ленту для обозначения флаконов и пипеток для каждого гена. Используя пипетки Пастера, сортим эмбрионы.Есть, как правило, не более 12 эмбрионов на флакон, после сортировки. Затем установите трясущимся водяной бане до 70 градусов по Цельсию. Тщательно вытянуть метанол во флаконах отсортированных эмбрионов и заменить его 500 микролитров свежего 100%-ного метанола.Вымойте эмбрионы кратко в течение примерно одной минуты на платформе шейкер. После этого, регидратировать эмбрионы в возрастающей концентрации 1x PBS с Tween 20 на платформе шейкер, как указано в текстовом протоколе. Для начала поместите небольшую прокладку с сетчатым дном в вращающуюся водяную баню, которая была разогрета до 70 градусов по Цельсию.Поместите алициты буфера гибридизации минус и буфер гибридизации плюс в прокладку. Аккуратно добавьте подготовленный раствор PK во флаконы эмбрионов, гарантируя, что все ткани полностью покрыты раствором. Перенесите флаконы на шейкер платформы и дайте им переварить в белковом растворе K рабочий раствор в течение примерно 12 минут.После этого осторожно свяжте раствор ПК и кратко затопите флакон PBT, чтобы разбавить оставшийся ПК. Замените решение PBT на 500 микролитров свежего PBT и дайте раствору промыть на платформе шейкер в течение пяти минут. Затем замените решение PBT на 500 микролитров оттаяли 4%PFA. Пусть эмбрионы инкубируются на шейкере платформы при комнатной температуре в течение 20 минут.Чтобы начать предгигигилитизацию, добавьте 500 микролитров довоенной гибридизации буфера минус раствор эмбрионсодержащих флаконов. Аккуратно поместите флаконы в прокладку в водяной бане при 70 градусах по Цельсию, не встряхивая в течение пяти минут. Далее свяжь буфер гибридизации минус раствор и затопит флаконы 500 микролитров довоенного буфера гибридизации плюс раствор.Поместите флаконы обратно в прокладку в водяной бане и инкубировать с встряхивания либо в течение четырех часов или на ночь. Чтобы начать гибридизацию, вырисуйте буфер гибридизации плюс из флаконов и замените его 500 микролитров свежего довоенного буфера гибридизации плюс. Аккуратно добавьте два микролитров РНК-зонда к каждому флакону и аккуратно закружить, чтобы обеспечить равномерное распределение зонда.Инкубировать в водяной бане при 70 градусах по Цельсию на ночь при встряхивании при 40 об/мин. Для начала подготовьте микроцентрифуговые трубки с пометкой буфер гибридизации плюс с геном интереса РНК-зонда, как указано в текстовом протоколе. Установите две 15-миллилитровые конические трубки и добавьте 0,2 грамма блокирующего реагента и 10 миллилитров MABT.Поместите обе трубки на ореховый миксер до тех пор, пока реагент полностью не растворится в растворе. С помощью стеклянной пипетки Pasteur свяжте буфер гибридизации плюс и раствор зонда и поместите его в стерильную помеченную микроцентрифугную трубку. Храните эту трубку в морозильной камере при температуре минус 20 градусов по Цельсию для дальнейшего использования.Аккуратно добавьте 500 микролитров теплого солевого цитрата натрия и буфер гибридизации минус разбавления. Инкубировать в последовательных решений в течение 10 минут каждый в тряске водяной бане, а затем при комнатной температуре на платформе шейкер, как указано в текстовом протоколе. После последней инкубации замените 100%PBT с каждого флакона 500 микролитров MABT.Повторите этот процесс дважды в течение пяти минут каждый. Во-первых, удалить MABT из каждого флакона и затопить его с предварительно смешанным блокирующим раствором из одной из 15-миллилитровых конических труб. Поместите оба флакона на ореховый миксер в течение четырех часов при комнатной температуре.Добавьте два микролитров фрагментов антитела ко второй трубке подготовленного блокирующего раствора и кратко вихрю. Затем заполните каждый флакон почти полностью блокирующим раствором и поместите их на ореховый миксер на ночь в холодильнике при четырех градусах по Цельсию. Для начала подготовьте фондовый флакон 10%NGS в MABT.Замените блокирующий раствор в каждом флаконе 500 микролитров этого решения NGS. Инкубировать при комнатной температуре на платформе шейкера в течение 25 минут. После этого замените смесь NGS на 500 микролитров 100%MABT.Инкубировать на платформе шейкер при комнатной температуре в течение 30 минут. Повторите это полоскание еще 11 раз в течение дня, каждые 30 минут. Затем заполните каждый флакон 100%MABT и поместите их на ореховый миксер на ночь в холодильнике при четырех градусах по Цельсию.Во-первых, заменить MABT в каждом флаконе с одним миллилитров буфера AP и дайте ему мыть в течение пяти минут. Повторите эту стирку дважды, чтобы полностью удалить MABT. Затем замените буфер AP на один миллилитр свежего буфера AP, содержащий 3,5 микролитров BCIP и 4,5 микролитров MBT.Замените это свежей смесью буфера AP, содержащего BCIP и MBT каждый час, пока реакция не будет завершена, убедившись, что контролировать реакцию внимательно и проверять каждые 15 минут, пока желаемый уровень окрашивания не был достигнут. Остановите реакцию окраски путем полоскания эмбрионов в растущей концентрации 1X PBT в буфере AP, как указано в протоколе. Промыть эмбрионы примерно в пяти миллилитров 100% PBT на ореховый смеситель до желаемого минимального фонового окрашивания не будет достигнуто.Когда полоскания завершена, мыть эмбрионы в 500 микролитров стерильных PBS на платформе шейкер и postfix образцов, как указано в текстовом протоколе. После полоскания эмбрионов, поместите их в четыре миллилитров 100% стерильных PBS и при необходимости хранить их в долгосрочной перспективе на четыре градуса по Цельсию. В этом исследовании эмбриональные образцы астианакса помечены для высококачественного анализа экспрессии генов.Этот процесс успешно внедрен как в пашон пещерных рыб, так и в эмбрионах поверхностных рыб. Эмбрионы cavefish, помеченные для экспрессии Sox9, демонстрируют четкую маркировку в развивающихся ветвях арок и грудного плавника. Обратите внимание, что окрашивание практически отсутствует в желтковом мешке или развивающихся somites на фланге.Аналогичным образом, выражение Tfap2a проявляется в части развивающейся головы, как ранняя миграция нейронных клеток гребня вдоль спинного фланга области эмбриона. Третий ген, представленный для эмбрионов пещерных рыб, Phf20a, виден в порциях соматических мезодермов и задней головы, которые суждено привести к костлявой ткани. Поверхностные эмбрионы рыб, помеченные для CXCR, показывают положительную маркировку в изолированных областях головы и фланга, а также несколько отдельных клеток, облив желтковый мешок.Ген Adcyap1a выражается в регионах центральной нервной системы, включая клетки гипофиза. Обратите внимание на высокоспецифическое выражение в парных двусторонних скоплениях клеток на спинной аспект эмбриона, а также большую область экспрессии средней линии. Последний ген, исследованный для эмбрионов пещерных рыб, Sox10, очевиден как ранний маркер нервного гребня на левой и правой сторонах спинного эмбриона.После завершения на месте, мы обычно изображение наших результатов с помощью световой микроскопии. Лучше всего сделать это в течение двух недель после завершения, чтобы избежать деградации окрашивания.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Понимание начале Органогенез, используя упрощенную<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация Протокола в<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Мульти-целевой Хромогенный Всего монтажа<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация для сравнения экспрессии генов доменов в<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Визуализация Multiciliated клетки в Zebrafish через комбинированные протокола вся гора флуоресцентные в Situ Гибридизация и иммунофлуоресценции

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Использование флюоресценции в Situ гибридизация (рыбы) для контроля состояния руку сплоченности в Прометафаза и метафаза я дрозофилы ооцитов

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Генотипирование и количественная оценка в Ситу Гибридизации Окрашивание в зебрафиш

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Целая гора В Ситу Гибридизация в зебрафиш эмбрионов и трубоусветки Ассав в iPSC-ECs для изучения роли эндоглин в сосудистом развитии

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Флуоресцентные изображения кальция и последующей на месте гибридизации для нейрональной характеристики прекурсоров в Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Постепенные изменения температуры для максимального размножения и нереста у Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...