Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de bruto para comentarios de este manuscrito. Queremos reconocer a cuatro estudiantes de secundaria que utilizan este protocolo durante las pasantías de verano en 2017 y 2018, incluyendo Christine Cao, Michael Warden, Aki Li y David Nwankwo. HL fue apoyado por una beca de madre de Biología UC durante el verano de 2017. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la National Science Foundation (DEB-1457630 a la JBG) y el institutos nacionales de Dental e investigación craneofacial (NIH; DE025033 a la JBG).

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Cincinnati (Protocolo nº 10-01-21-01).
1. fijación
<ol><li>Número deseado de Astyanax mexicanus embriones de un tanque de cría de aislar y fijar ~ 50 embriones a la vez. Si los embriones son grandes y viejos, puede ser necesario fijar 25 a la vez para asegurar incluso la fijación.</li>
	<li>Dependiendo de la edad del embrión, utilizar el m...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

Debido a la vulnerabilidad del ARN a la degradación, uno de los pasos más importantes en el protocolo refiere a la síntesis estéril de la sonda de RNA. Sin embargo, si una sonda se genera con cuidado y proporciona buenos resultados, pueden ser reutilizado en posteriores reacciones de tinción. Un segundo paso crucial es la cuidadosa producción de todos los reactivos utilizados en el protocolo. Puesto que este protocolo trata de varios días y muchos pequeños pasos, es esencial que todos los reactivos son exactament...

Hibridación in situ es un método común para la tinción de tejidos fijos para visualizar patrones de expresión de gen1. Esta técnica se ha realizado durante años en otros tradicionales2 y sistemas no tradicionales3 modelo para una variedad de estudios biológicos. Sin embargo, varios pasos y los reactivos son necesarios para realizar exitosamente este procedimiento. Para los investigadores que nunca han realizado esta técnica, iniciando el proceso puede ser intimidante debido a los muchos pasos necesarios. Además, la larga naturaleza de este procedimiento se presta a errores técnicos, que pueden ser difícil solucionar problemas.
El objetivo general de este artículo es presentar un método simple y sencillo que se puede representar esta técnica de hibridación accesible a un público más amplio. Para reducir la introducción de errores, presentamos un enfoque sencillo que produce alta calidad gene expresión manchas y reduce al mínimo la señal de fondo no específicas. Este procedimiento es similar a otros enfoques desarrollados en los sistemas de modelo tradicional, como Danio rerio4. Aquí, nuestro objetivo es facilitar la aplicación cuidadosa de cada paso usando una lista descargable (1 archivo suplementario), para promover el cuidado de aplicación del protocolo. La justificación para hacer esto es para facilitar la organización a través de los muchos pasos implicados en este procedimiento. Este artículo es apropiado para los investigadores interesados en realizar la hibridación in situ de montaje en conjunto en el desarrollo de embriones, pero aún no han realizado el procedimiento. La ventaja del enfoque elegido por los investigadores de Astyanax es que ha sido probado y comprobado en cavefish y morfos de peces de superficie, facilitando así el análisis comparativo de la expresión. El método presentado puede utilizarse por los investigadores en estudios sobre Astyanax y otros sistemas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

En los últimos años, se ha publicado un genoma de proyecto para el cavefish mexicano ciego (Astyanax mexicanus), revelando las identidades de la secuencia de miles de genes. Investigaciones anteriores en este sistema de modelo emergente capitalizan completo genoma las investigaciones que han identificado numerosos loci de rasgos cuantitativos (QTL) asociados con diversos fenotipos asociados de cueva. Sin embargo, la capacidad de conectarse a genes de interés a la base hereditaria para cambio fenotípico sigue siendo un desafío significativo. Una técnica que puede facilitar la comprensión del papel del desarrollo en evolución troglomórphico es todo montaje hibridación in situ. Esta técnica puede implementarse directamente comparar la expresión génica entre las formas de vivienda de la cueva y la superficie, nominar a candidato genes subyacentes QTL establecido, identificar los genes de interés de los estudios de secuenciación de próxima generación, o desarrollar otros enfoques basados en el descubrimiento. En este informe, presentamos un protocolo simple, apoyado por una lista flexible, que puede ser ampliamente adaptada para su uso más allá del sistema de estudio presentados. Se espera que este protocolo puede servir como un recurso amplio para la comunidad de Astyanax y más allá.

En este informe, nos ofrece un enfoque sencillo para realizar etiquetado de embrionario Astyanax muestras para análisis de expresión génica de alta calidad. Esta técnica puede realizarse en cuatro o cinco días, y cada paso principal en el procedimiento se representa en un diagrama de flujo con códigos de color (figura 1). Una vez completado, embriones teñidos deben abrigar una etiqueta cromática púrpura oscurezca en tejidos que expresan el g...

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Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Este protocolo permite la visualización de la expresión génica en embrionario Astyanax cavefish. Este enfoque ha sido desarrollado con el objetivo de maximizar la señal de la expresión del gene, minimizando tinción de fondo inespecífica.

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Nuestro protocolo in situ es significativo porque proporciona una forma sencilla de visualizar patrones de expresión génica con una tinción de fondo mínima. Esta técnica hace que un protocolo complicado y largo sea relativamente fácil de realizar. Las sugerencias de configuración de sobremesa y las listas de comprobación proporcionadas hacen que este protocolo sea aún más fácil de realizar correctamente y reproducir.Si bien las técnicas que se muestran aquí son específicas de Astyanax mexicanus, es probable que se adapten a otros sistemas de individuos de tamaño comparable con pequeños ajustes al protocolo. En primer lugar, utilice cinta de laboratorio de color para designar viales y pipetas para cada gen. Usando una pipeta Pasteur, clasifú los embriones.Por lo general, no hay más de 12 embriones por vial, una vez clasificados. A continuación, establezca un baño de agua agitado a 70 grados centígrados. Extraiga cuidadosamente el metanol en los viales de embriones clasificados, y reemplácelo con 500 microlitros de metanol fresco 100%.Lave los embriones brevemente durante aproximadamente un minuto en una coctelera de plataforma. Después de esto, rehidratar los embriones en una concentración creciente de 1x PBS con Tween 20 en un agitador de plataforma como se describe en el protocolo de texto. Para comenzar, coloque una pequeña junta con un fondo de malla en el baño de agua giratorio que se ha precalentado a 70 grados centígrados.Coloque alícuotas de búfer de hibridación menos e buffer de hibridación más en la junta. Añadir suavemente una solución de PK preparada a los viales de embriones para asegurar que todos los tejidos estén completamente cubiertos de solución. Transfiera los viales a una coctelera de plataforma y déjelos digerir en la solución de trabajo de proteinasa K durante aproximadamente 12 minutos.Después de esto, extraiga suavemente la solución PK e inunde brevemente el vial con PBT para diluir el PK restante. Sustituya la solución PBT por 500 microlitros de PBT fresco y deje que la solución enjuague en la coctelera de plataforma durante cinco minutos. A continuación, sustituya la solución PBT por 500 microlitros de descongelado 4%PFA. Deje que los embriones se incuban en el agitador de plataforma a temperatura ambiente durante 20 minutos.Para comenzar la pre-hibridación, añada 500 microlitros de tampón de hibridación precalentado menos solución a los viales que contienen embriones. Coloque cuidadosamente los viales en la junta en el baño de agua a 70 grados centígrados sin agitar durante cinco minutos. A continuación, extraiga el tampón de hibridación menos solución e inunde los viales con 500 microlitros de tampón de hibridación preadnciado más solución.Vuelva a colocar los viales en la junta en el baño de agua e incubar con agitación durante cuatro horas o durante la noche. Para comenzar la hibridación, extraiga el búfer de hibridación más de los viales y sustitúyalo por 500 microlitros de tampón de hibridación precalentado fresco más. Agregue cuidadosamente dos microlitros de sonda de ARN a cada vial y gire suavemente para asegurar una distribución uniforme de la sonda.Incubar en el baño de agua a 70 grados centígrados durante la noche mientras se agita a 40 RPM. Para empezar, prepare tubos de microcentrífuga etiquetados como tampón de hibridación más con el gen de la sonda de ARN de interés como se describe en el protocolo de texto. Establezca dos tubos cónicos de 15 mililitros y añada 0,2 gramos de reactivo de bloqueo y 10 mililitros de MABT.Coloque ambos tubos en un mezclador nutating hasta que el reactivo se disuelva completamente en la solución. Con una pipeta Pasteur de vidrio, extraiga el tampón de hibridación más y la solución de sonda y colóquelo en un tubo de microcentrífuga etiquetado estéril. Guarde este tubo en el congelador a menos 20 grados centígrados para su uso futuro.Agregue cuidadosamente 500 microlitros del citrato de sodio salino caliente y el tampón de hibridación menos diluciones. Incubar en soluciones secuenciales durante 10 minutos cada una en el baño de agua agitada, y luego a temperatura ambiente en una coctelera de plataforma como se describe en el protocolo de texto. Después de la última incubación, sustituya el 100% PBT de cada vial por 500 microlitros de MABT.Repita este proceso dos veces durante cinco minutos cada uno. En primer lugar, retire el MABT de cada vial e inunde con una solución de bloqueo premezclada de uno de los tubos cónicos de 15 mililitros. Coloque ambos viales en el mezclador nutating durante cuatro horas a temperatura ambiente.Añadir dos microlitros de los fragmentos de anticuerpos al segundo tubo de solución de bloqueo preparada y vórtice brevemente. A continuación, llene cada vial casi por completo con solución de bloqueo y colóquelos en un mezclador nutrido durante la noche en un refrigerador a cuatro grados centígrados. Para comenzar, prepare un vial de 10%NGS en MABT.Sustituya la solución de bloqueo de cada vial por 500 microlitros de esta solución NGS. Incubar a temperatura ambiente en la coctelera de plataforma durante 25 minutos. Después de esto, reemplace la mezcla NGS con 500 microlitros de 100%MABT.Incubar en la coctelera de plataforma a temperatura ambiente durante 30 minutos. Repita este enjuague 11 veces más durante todo el día, cada 30 minutos. A continuación, llene cada vial con 100% MABT y colóquelos en un mezclador nutating durante la noche en un refrigerador a cuatro grados centígrados.En primer lugar, reemplace el MABT en cada vial con un mililitro de tampón AP y déjelo lavar durante cinco minutos. Repita este lavado dos veces para retirar completamente el MABT. Entonces substituya el buffer AP con un mililitro del buffer AP fresco que contiene 3.5 microlitros del BCIP y 4.5 microlitros del MBT.Sustituya esto por una mezcla fresca de tampón AP que contenga el BCIP y el MBT cada hora hasta que se complete la reacción, asegurándose de monitorear la reacción de cerca y comprobar cada 15 minutos hasta que se haya alcanzado el nivel deseado de tinción. Detenga la reacción de coloración enjuagando los embriones en una concentración creciente de 1X PBT en el búfer AP como se describe en el protocolo. Enjuague los embriones en aproximadamente cinco mililitros de 100% PBT en un mezclador nutating hasta que se alcance la tinción mínima de fondo deseada.Cuando el enjuague esté completo, lave los embriones en 500 microlitros de PBS estériles en un agitador de plataforma y coloque las muestras como se describe en el protocolo de texto. Después de enjuagar los embriones, colóquelos en cuatro mililitros de PBS 100% estéril y, si es necesario, guárdelos a largo plazo a cuatro grados centígrados. En este estudio, los especímenes embrionarios de Astyanax están etiquetados para el análisis de expresión génica de alta calidad.Este proceso se ha implementado con éxito tanto en el pez cueva de Pachon como en los embriones de peces de superficie. Los embriones de pez cueva etiquetados para la expresión Sox9 demuestran un etiquetado claro en los arcos ramificados en desarrollo y la aleta pectoral. Tenga en cuenta que la tinción está prácticamente ausente en el saco de yema o en las somitas en desarrollo en el flanco.Del mismo modo, la expresión de Tfap2a es evidente en las porciones de la cabeza en desarrollo como células de cresta neural de migración temprana a lo largo de la región del flanco dorsal del embrión. El tercer gen presentado para los embriones de pez cueva, Phf20a, se observa en las porciones del mesodermo somático y la cabeza posterior que están destinados a dar lugar a tejido óseo. Los embriones de peces de superficie etiquetados para CXCR muestran un etiquetado positivo en regiones aisladas de la cabeza y el flanco, así como algunas células individuales que cubren el saco de yema.El gen Adcyap1a se expresa en regiones del sistema nervioso central, incluidas las células pituitarias. Observe la expresión altamente específica en grupos bilaterales emparejados de células en el aspecto dorsal del embrión, así como una región más grande de expresión de línea media. El último gen examinado para los embriones de pez cueva, Sox10, es evidente como un marcador temprano de la cresta neural en los lados izquierdo y derecho del embrión dorsal.Después de completar in situ, normalmente imagen de nuestros resultados utilizando microscopía de luz. Lo mejor es hacer esto dentro de las dos semanas después de la finalización con el fin de evitar la degradación de la tinción.

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Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

La comprensión temprana Organogenesis Usando una simplificado<em&gt; In Situ</em&gt; Protocolo de hibridación en<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-objetivo Cromogénico Todo el montaje<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación para comparar dominios de expresión génica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

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Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

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Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotipado y cuantificación de la tinción de hibridación in situ en el pez cebra

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Hibridación en situ de montaje completo en embriones de pez cebra y ensayo de formación de tubos en iPSC-CE para estudiar el papel de la endoglina en el desarrollo vascular

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Imágenes fluorescentes de calcio y posterior hibridación in situ para la caracterización de precursores neuronales en Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Cambios incrementales de temperatura para la cría y el desove máximos en Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...