Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Författarna vill tacka medlemmarna i brutto lab för hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. Vi vill uppmärksamma fyra gymnasieelever som utnyttjade detta protokoll under sommaren praktik i 2017 och 2018, inklusive Christine Cao, Michael Warden, Aki Li och David Nwankwo. HL stöddes av en UC biologi STEM gemenskap under sommaren 2017. Detta arbete stöds av bidrag från National Science Foundation (DEB-1457630 till JBG), nationella institut av tandvård och kraniofaciala forskning (NIH; DE025033 till JBG).

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Cincinnati (protokoll nr 10-01-21-01).
1. fixering
<ol><li>Isolera önskat antal Astyanax mexicanus embryon från en avel tank och åtgärda ~ 50 embryon i taget. Om embryon är stora och gamla, kan det vara nödvändigt att fixa 25 samtidigt för att säkerställa jämn fixering.</li>
	<li>Beroende på ålder av embryot, använder du metoden IACUC go...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

På grund av RNA sårbarhet för nedbrytning gäller en av de viktigaste stegen i protokollet sterila syntesen av RNA sonden. Dock om en sond genereras noga och ger bra resultat, kan den återanvändas i efterföljande färgning reaktioner. En andra avgörande steget är noga med produktionen av alla reagenser som används i hela protokollet. Eftersom detta protokoll innebär flera dagar och många små steg, är det viktigt att alla reagenser är korrekt produceras och lagras i ett sterilt sätt. Vidare är det principi...

In situ hybridisering är en vanlig metod för färgning fasta vävnader för att visualisera gen uttryck mönster1. Denna teknik har utförts i år i andra traditionella2 och icke-traditionella3 modellsystem, för en mängd olika biologiska studier. Dock är flera steg och reagenser nödvändiga för att kunna utföra denna procedur. För utredare som aldrig har utfört denna teknik, kan det vara skrämmande på grund av de många olika stegen att inleda processen. Dessutom lämpar långa arten av denna procedur sig för tekniska fel, som kan vara svårt för att felsöka.
Det övergripande målet för den här artikeln är att presentera en enkel och okomplicerad metod som kommer att göra denna hybridisering teknik tillgänglig för en bred publik. För att minska införandet av fel, presenterar vi en okomplicerad metod som ger hög kvalitet gen uttryck färgning och minimerar icke-specifik bakgrund signal. Proceduren liknar andra strategier som utvecklats i traditionell modellsystem, såsom Danio rerio4. Här, vi strävar efter att underlätta noggrann genomförandet av varje steg använder en nedladdningsbara checklista (kompletterande fil 1), att främja försiktig genomförande av protokollet. Motiven för att göra detta är att underlätta organisationen genom de många olika stegen i den här proceduren. Denna artikel är lämpligt för forskare som är intresserade av att utföra hela-mount in situ hybridisering i utvecklingen av embryon, men ännu inte har utfört proceduren. Fördelen med den valda metoden för Astyanax forskare är att det har testats och visat i både släktet och ytan fisk morphs, därigenom underlätta jämförande uttryck analyser. Denna metod kan användas av forskare i studier på Astyanax och andra system.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

Under de senaste åren har ett utkast till genomet för den blinda mexikanska släktet (Astyanax mexicanus) släppts, avslöjar sekvens identiteter för tusentals gener. Tidigare forskning i detta framväxande modellsystem aktiveras på omfattande genome-wide utredningar som har identifierat ett flertal kvantitativa loci (QTL) associerade med olika cave-associerade fenotyper. Möjlighet att ansluta gener av intresse till den ärftliga grunden för fenotypisk förändring är dock fortfarande en stor utmaning. En teknik som kan underlätta djupare förståelse av utvecklingen i troglomorphic evolution roll är hela-mount in situ hybridisering. Denna teknik kan genomföras för att direkt jämföra genuttryck mellan - och surface-grottboende former, nominera kandidat gener bakom etablerade QTL, identifiera gener av intresse från nästa generations sekvensering studier eller utvecklar andra Discovery-baserade metoder. I denna rapport presenterar vi ett enkelt protokoll, stöds av en flexibel checklista, som allmänt kan anpassas för användning utöver presenterade studien systemet. Förhoppningen är att detta protokoll kan tjäna som en bred resurs för Astyanax gemenskapen och bortom.

I denna rapport ger vi en enkel och okomplicerad metod för att utföra märkning av embryonala Astyanax exemplar för högkvalitativa gen uttryck analys. Denna teknik kan utföras antingen fyra eller fem dagar, och varje huvudsakliga steg i förfarandet är representerad i ett färgkodade flödesschema (figur 1). När klar, bör färgade embryon hysa en mörk lila kromatisk etikett i vävnader som uttrycker den särskild gen av intresse. Vi har fram...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Detta protokoll möjliggör visualisering av genuttryck i embryonala Astyanax släktet. Detta synsätt har utvecklats med målet att maximera gen uttryck signal, samtidigt minimera ospecifika bakgrundsfärgning.

Wholemount In Situ hybridisering för Astyanax embryon

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Vår in situ protokollet är betydande eftersom det ger ett enkelt sätt att visualisera genuttryck mönster med minimal bakgrund färgning. Denna teknik gör ett komplicerat och långdragna protokoll relativt lätt att utföra. Bänkskiva ställa in förslag och checklistor som tillhandahålls göra detta protokoll ännu enklare att utföra korrekt och reproducera.Medan de tekniker som visas här är specifika för Astyanax mexicanus, det kan sannolikt anpassas till andra system av comparably storlek individer med små justeringar av protokollet. Först använder färgade lab tejp för att utse injektionsflaska och pipetter för varje gen. Sortera embryona med hjälp av en Pasteurpipett.Det finns vanligtvis inte mer än 12 embryon per injektionsflaska, en gång sorterade. Därefter ställer du in ett skakande vattenbad till 70 grader Celsius. Dra försiktigt ut metanol i injektionsflaskan med sorterade embryon och ersätt den med 500 mikroliter färska 100%metanol.Tvätta embryona kort i ungefär en minut på en plattformsskak. Efter detta rehydrera embryona i en ökande koncentration av 1x PBS med Tween 20 på en plattformsskakner som beskrivs i textprotokollet. Till att börja placera en liten packning med en nätbotten i det roterande vattenbadet som har förvärmts till 70 grader Celsius.Placera alikvoter av hybridiseringsbuffert minus och hybridiseringsbuffert plus i packningen. Tillsätt försiktigt en beredd PK-lösning till injektionsflaskan med embryon som säkerställer att alla vävnader är helt täckta av lösning. Överför injektionsflaskan till en plattformsskakner och låt dem smälta i proteinas K arbetslösningen i cirka 12 minuter.Efter detta, dra försiktigt av PK-lösningen och underspädning kort av injektionsflaskan med PBT för att späda ut resterande PK. Byt ut PBT-lösningen mot 500 mikroliter färska PBT och låt lösningen skölja på plattformsskaknören i fem minuter. Byt sedan ut PBT-lösningen mot 500 mikroliter av tinade 4%PFA. Låt embryona ruva på plattformsskakerna i rumstemperatur i 20 minuter.För att börja före hybridisering, tillsätt 500 mikroliter av förkrigshybridisering buffert minus lösning till embryo-innehållande injektionsflaska. Placera försiktigt injektionsflaskan i packningen i vattenbadet i 70 grader Celsius utan att skaka i fem minuter. Nästa dra bort hybridiseringsbuffert minus lösning och översvämma injektionsflaskan med 500 mikroliter av förkrigade hybridiseringsbuffert plus lösning.Placera injektionsflaskan tillbaka i packningen i vattenbadet och inkubera med skakning antingen i fyra timmar eller över natten. För att börja hybridisering, dra hybridiseringsbuffert plus ut av injektionsflaskan och ersätta den med 500 mikroliter av färska förkrigsmed hybridisering buffert plus. Tillsätt försiktigt två mikroliter av RNA-sond till varje injektionsflaska och snurra försiktigt för att säkerställa jämn fördelning av sonden.Inkubera i vattenbadet vid 70 grader Celsius över natten medan du skakar vid 40 RPM. Till att börja med förbereda microcentrifug rör märkta hybridisering buffert plus med genen av intresse RNA sond som beskrivs i textprotokollet. Ställ ut två 15-milliliter koniska rör och tillsätt 0,2 gram blockerande reagens och 10 milliliter MABT.Placera båda rören på en nötblandare tills reagensen är helt upplöst i lösningen. Med hjälp av en glas Pasteur pipett dra bort hybridisering buffert plus och sond lösning och placera den i en steril märkt microcentrifug röret. Förvara detta rör i frysen vid minus 20 grader Celsius för framtida bruk.Tillsätt försiktigt 500 mikroliter av den varma saltlösning natriumcitrat och hybridisering buffert minus utspädningar. Inkubera i sekventiella lösningar i 10 minuter vardera i skakningsvattenbadet, och sedan i rumstemperatur på en plattformsskaktor enligt textprotokollet. Efter den sista inkubationen, byt ut 100%PBT från varje injektionsflaska med 500 mikroliter MABT.Upprepa denna process två gånger i fem minuter vardera. Ta först bort MABT från varje injektionsflaska och översvämma den med förblandad blockeringslösning från ett av de koniska 15-milliliter-rören. Placera båda injektionsflaskan på den nötande mixern i fyra timmar i rumstemperatur.Lägg till två mikroliter av antikroppsfragmenten till det andra röret av beredd blockerande lösning och kort vortex. Fyll sedan varje injektionsflaska nästan helt med blockerande lösning och placera dem på en nötande mixer över natten i ett kylskåp vid fyra grader Celsius. Till att börja med bered en lagerflaska på 10%NGS i MABT.Byt ut blockeringslösningen i varje injektionsflaska mot 500 mikroliter av denna NGS-lösning. Inkubera i rumstemperatur på plattformsskaknare i 25 minuter. Efter detta, byt ut NGS-blandningen med 500 mikroliter på 100%MABT.Inkubera på plattformsskaknare i rumstemperatur i 30 minuter. Upprepa denna sköljning 11 gånger under hela dagen, var 30:e minut. Fyll sedan varje injektionsflaska med 100%MABT och placera dem på en nötande mixer över natten i ett kylskåp vid fyra grader Celsius.Först byt ut MABT i varje injektionsflaska med en milliliter AP-buffert och låt den tvätta i fem minuter. Upprepa denna tvätt två gånger för att helt ta bort MABT. Byt sedan ut AP-bufferten mot en milliliter färsk AP-buffert som innehåller 3,5 mikroliter av BCIP och 4,5 mikroliter MBT.Ersätt detta med en färsk blandning av AP-buffert som innehåller BCIP och MBT varje timme tills reaktionen är klar, se till att övervaka reaktionen noga och kontrollera var 15:e minut tills önskad färgningsnivå har uppnåtts. Stoppa färgningsreaktionen genom att skölja embryona i en ökande koncentration av 1X PBT i AP-buffert som beskrivs i protokollet. Skölj embryona i cirka fem milliliter på 100 %PBT på en nötblandare tills önskad minsta bakgrundsfärgning har uppnåtts.När sköljningen är klar, tvätta embryon i 500 mikroliter av steril PBS på en plattform shaker och postfix exemplaren som beskrivs i textprotokollet. Efter sköljning av embryon, placera dem i fyra milliliter av 100%steril PBS och om det behövs lagra dem på lång sikt vid fyra grader Celsius. I denna studie är embryonala Astyanax-exemplar märkta för högkvalitativ genuttrycksanalys.Denna process har genomförts framgångsrikt i både Pachon grottfisk och embryon yta fisk. Cavefish embryon märkt för Sox9 uttryck visar tydlig märkning i utveckla branchial bågar och bröstfena. Observera att färgning är praktiskt taget frånvarande i gulesäcken eller den utvecklande somiter på flanken.På samma sätt är Tfap2a uttryck tydligt i de delar av det utvecklande huvudet som tidig migration neurala crest celler längs dorsala flanken regionen av embryot. Den tredje genen som presenteras för cavefish embryon, Phf20a, ses i de delar av somatiska mesotderm och bakre huvudet som är avsedda att ge upphov till beniga vävnad. Ytfiskembryon som är märkta för CXCR visar positiv märkning i isolerade regioner i huvud och flank, samt några enskilda celler som överlyder gulesäcken.Genen Adcyap1a uttrycks i regioner i centrala nervsystemet inklusive hypofysceller. Observera det högspecifika uttrycket i parade bilaterala kluster av celler på den dorsala aspekten av embryot, samt en större region mittlinjen uttryck. Den sista genen som undersökts för cavefish embryon, Sox10, är uppenbart som en tidig markör för neurala krön på vänster och höger sida av dorsala embryot.Efter att ha avslutat in situ, vi typiskt bild våra resultat med hjälp av ljus mikroskopi. Det är bäst att göra detta inom två veckor efter avslutad för att undvika nedbrytning av färgning.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Förstå Tidig Organogenesis användning av en förenklad<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering protokollet<em&gt; Xenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-mål Kromogent Whole-mount<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering för jämförelse Gene Expression domäner i<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryon

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualisera Multiciliated celler i zebrafisk genom en kombinerad protokoll av hela Mount fluorescerande In Situ hybridisering och immunofluorescens

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Med fluorescens In Situ hybridisering (FISH) för att övervaka tillståndet för Arm sammanhållning i metafasen och metafas I Drosophila oocyter

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Genotypning och kvantifiering av In Situ Hybridisering Färgning i Zebrafish

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Helmonterad in situ-hybridisering i Zebrafish Embryon och Tube Formation Assay i iPSC-ECs att studera rollen av Endoglin i vaskulär utveckling

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescerande kalciumavbildning och efterföljande in situ hybridisering för neuronal prekursor karakterisering i Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Stegvisa temperaturförändringar för maximal avel och gytning i Astyanax mexicanus

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...