Name: wholemount in situ hybridization for astyanax embryos
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Yazarlar bu makale yararlı yorumlar için brüt laboratuvar üyeleri teşekkür etmek istiyorum. 2017 ve 2018 Christine Cao, Michael müdür, Aki Li ve David Nwankwo dahil olmak üzere, yaz staj sırasında bu iletişim kuralı kullanıldığında dört lise öğrencileri kabul etmek istiyorum. HL 2017 yaz aylarında UC Biyoloji Kök bursu tarafından desteklenmiştir. Bu eser Ulusal Bilim Vakfı (JBG için DEB-1457630) ve ulusal kurumları diş ve Fasiyal araştırma (NIH; gelen hibe tarafından desteklenmiştir JBG için DE025033).

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Cincinnati Üniversitesi (iletişim kuralı #10-01-21-01) tarafından onaylanmış olması.
1. fiksasyon
<ol><li>İstediğiniz bir üreme tanktan Astyanax mexicanus embriyo sayısını belirleyip ~ 50 embriyo teker teker çözmek. Embriyo büyük ve eski ise, 25 hatta fiksasyon sağlamak için teker teker düzeltmek gerekli olabilir.</li>
	<li>Embriyo yaş bağlı olarak, anestezi IACUC onaylı yö...

<ol>
	<li>Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).</li><li>Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-myc+proto-oncogene+expression+during+organogenesis+in+the+developing+mouse+as+revealed+by+in+situ+hybridization.">N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).</li><li>Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cranial+patterning+in+the+direct&#8208;developing+frog+Eleutherodactylus+coqui+revealed+through+gene+expression.">Early cranial patterning in the direct&#8208;developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression.</a> Evolution &amp; Development. 12 (4), 373-382 (2010).</li><li>Thisse, C., Thisse, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+in+situ+hybridization+to+whole-mount+zebrafish+embryos.">High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos.</a> Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).</li><li>Cheung, M., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+development+is+regulated+by+the+transcription+factor+Sox9.">Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9.</a> Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).</li><li>Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lockjaw+encodes+a+zebrafish+tfap2a+required+for+early+neural+crest+development.">lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development.</a> Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).</li><li>Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHF20+positively+regulates+osteoblast+differentiation+via+increasing+the+expression+and+activation+of+Runx2+with+enrichment+of+H3K4me3.">PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).</li><li>Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+&#945;-chemokine,+stromal+cell-derived+factor-1&#945;,+binds+to+the+transmembrane+G-protein-coupled+CXCR-4+receptor+and+activates+multiple+signal+transduction+pathways.">The &#945;-chemokine, stromal cell-derived factor-1&#945;, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).</li><li>Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assignments+of+the+genes+for+rat+pituitary+adenylate+cyclase+activating+polypeptide+(Adcyap1)+and+its+receptor+subtypes+(Adcyap1r1,+Adcyap1r2,+and+Adcyap1r3).">Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3).</a> Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).</li><li>Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Terminal+differentiation+of+myelin-forming+oligodendrocytes+depends+on+the+transcription+factor+Sox10.">Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10.</a> Genes &amp; Development. 16 (2), 165-170 (2002).</li><li>Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pnp4a+is+the+causal+gene+of+the+Medaka+Iridophore+mutant+guanineless.">pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).</li><li>Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+protocol+for+whole-mount+in+situ+hybridization+on+Xenopus+embryos.">A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).</li><li>Schulz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+Drosophila+testes.">In situ hybridization to Drosophila testes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).</li></ol>

Bozulması için RNA açığı nedeniyle iletişim kuralındaki en önemli adımlardan biri RNA prob steril sentezi ile ilgili. Bir sonda dikkatli bir şekilde oluşturulur ve iyi sonuçlar sağlar, ancak, bu sonraki boyama reaksiyonlar yeniden kullanılabilir. İkinci önemli bir adım boyunca protokolünün kullanılan tüm reaktifler dikkatli yapımıdır. Bu iletişim kuralı birkaç gün ve birçok küçük adımlar gerektirdiğinden, bu önemlidir tüm reaktifler doğru vardır üretilen ve steril bir şekilde depo...

İn situ hibridizasyon gen ifade desenleri1görselleştirmek için sabit dokular boyama için yaygın bir yöntemdir. Bu teknik için diğer geleneksel2 ve geleneksel olmayan3 model sistemleri, yıllardır biyolojik çalışmalar çeşitli yapıldı. Ancak, birkaç adım ve Kimyasalları başarıyla bu yordamı gerçekleştirmek gereklidir. Hiç bu teknik yapmadıysanız müfettişler için işlemini Başlatan birçok adımları nedeniyle korkutabilir. Ayrıca, bu yordamı uzun doğası ile ilgili sorun giderme için zorlu teknik hatalar için oldukça rahat.
Bu makalede genel amacı bu hibridizasyon teknik geniş bir kitleye için erişilebilir hale getirecek bir basit ve kolay yöntem sunmaktır. Giriş hataları azaltmak için yüksek kaliteli gen ifade boyama verimleri ve non-spesifik arka sinyal en aza indirir basit bir yaklaşım sunuyoruz. Bu yordamı diğer yaklaşımlar Danio rerio4gibi geleneksel modeli sistemlerde gelişmiş benzer. Burada, dikkatli dikkatli uygulama Protokolü'nün tanıtmak için indirilebilir bir kontrol listesi (ek dosya 1) kullanarak her adım uygulanması kolaylaştırmak hedefliyoruz. Bunu yapmak için gerekçe bu yordamda birçok adımlar ile organizasyon kolaylaştırmaktır. Bu makalede araştırmacılar embriyo geliştirilmesinde bütün-mount In situ hibridizasyon gerçekleştirmede baktılar için uygundur, ancak henüz işlem yapmamış. Astyanax araştırmacılar için seçilen yaklaşımı bu test edilmiş ve kanıtlanmış cavefish ve yüzey balık morphs, böylece karşılaştırmalı ifade analizleri kolaylaştırmak avantajdır. Astyanax ve diğer sistemlerde çalışmalarda araştırmacılar tarafından sunulan yöntem kullanılabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL Conical</td>
			<td>VWR-Greiner</td>
			<td>82050-278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89130-886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical</td>
			<td>VWR-Falcon</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filtration Unit</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89220-696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11093274910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8503-1G</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11 096 176 001</td>
			<td>50 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric Acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A104-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)</td>
			<td>Sigma-Roche</td>
			<td>11175025910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher-Decon</td>
			<td>04-355-223</td>
			<td>1 Gal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17899</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass dram vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66011-041</td>
			<td>1 Dr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td>
			<td>284000ACS</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3393-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride-crystalline</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M33-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maleic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0375-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td>4L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular-grade Water (RNase-free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-3</td>
			<td>3 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH pellets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBT Substrate powder</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>34035</td>
			<td>1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>31873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127-500g</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-20</td>
			<td>20L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (200mg/10ml)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>19133</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Pipettes</td>
			<td>VWR-Samco</td>
			<td>14670-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250mL</td>
			<td>250 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking Water Bath 12 L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10128-126</td>
			<td>12 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Analog Shaker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89032-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Millipore-OmniPur</td>
			<td>9210-500GM</td>
			<td>500 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA Yeast</td>
			<td>Fisher-Invitrogen</td>
			<td>15401011</td>
			<td>25 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50mL</td>
			<td>50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td>
			<td>50-728-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium Chloride (LiCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203637-10G</td>
			<td>10 g</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wholemount in situ hybridization for astyanax embryos

Son yıllarda, kör Meksika cavefish (Astyanax mexicanus) için bir taslak genom, binlerce gen için sıra kimlik açığa çıktı. Ortaya çıkan bu model sistem içine önceden araştırma çeşitli mağara ilişkili fenotipleri ile ilişkili çok sayıda nicel özellik loci (QTL) belirledik kapsamlı genom geniş araştırmalar üzerinde büyük harf. Ancak, faiz genler kalıtsal olarak fenotipik değiştirmek için bağlanma olanağı önemli bir meydan okuma kalır. Troglomorphic evrim gelişiminde rolü daha derin bir anlayış kolaylaştıran bir bütün-mount In situ hibridizasyon tekniktir. Bu teknik doğrudan gen ekspresyonu mağaralarda ve yüzey yaşayan biçimler arasında karşılaştırmak, kurulan QTL altında yatan genlerin aday, genlerin yeni nesil sıralama çalışmalar dan ilgi tanımlamak veya diğer geliştirmek için uygulanabilir keşif dayalı yaklaşımlar. Bu raporda, yaygın olarak sunulan çalışma sistemi çok ötesinde kullanmak için adapte edilebilir bir esnek denetim listesi tarafından desteklenen basit bir protokol tanıtacağız. Bu iletişim kuralı Astyanax toplum için ve ötesinde geniş bir kaynak olarak hizmet verebilir umulmaktadır.

Bu raporda, biz yüksek kaliteli gen ifade analizi için embriyonik Astyanax örneklerin etiketleme gerçekleştirmek için basit ve kolay bir yaklaşım sağlar. Bu teknik dört ya da beş gün içinde yürütülen olabilir ve yordamı asıl her adımda bir renk kodlu akış (şekil 1) temsil edilir. Bir kez tam, lekeli embriyo ilgi belirli gen ifade dokularda koyu mor renk etiket liman. Biz başarıyla bu protokole Pachón cavefish (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos at JoVE.com

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Bu iletişim kuralı embriyonik Astyanax cavefish gen ifadesinde görselleştirme sağlar. Bu yaklaşım belirsiz arka plan boyama en aza indirerek gen ifade sinyal, en üst düzeye çıkarma amacı ile geliştirilmiştir.

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

In situ protokolümüz önemlidir çünkü gen ekspresyonu desenlerini en az arka plan boyama ile görselleştirmenin basit bir yolunu sağlar. Bu teknik, karmaşık ve uzun bir protokolün gerçekleştirilmesini nispeten kolaylaştırır. Benchtop, bu protokolün doğru şekilde gerçekleştirilip yeniden oluşturulmasını kolaylaştıran öneriler ve denetim listeleri ayarlayın.Burada gösterilen teknikler Astyanax mexicanus'a özgü olsa da, protokole küçük ayarlamalar yapılan, nispeten büyük boyutlu bireylerin diğer sistemlerine adapte edilebilir. İlk olarak, her gen için şişe ve pipetler belirlemek için renkli laboratuvar bandı kullanın. Pasteur pipeti kullanarak embriyoları sıralayın.Şişe başına genellikle en fazla 12 embriyo vardır. Sonra, 70 santigrat derece bir sallayarak su banyosu ayarlayın. Dikkatle sıralanmış embriyoların şişeleri metanol dışarı çekmek ve taze% 100 metanol 500 mikrolitre ile değiştirin.Bir platform shaker üzerinde yaklaşık bir dakika için embriyolar kısa bir süre yıkayın. Bundan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi bir platform shaker üzerinde Tween 20 ile 1x PBS artan konsantrasyonda embriyolar rehydrate. Başlamak için, 70 santigrat derece önceden ısıtılmış olan dönen su banyosu içine bir örgü alt küçük bir conta yerleştirin.Conta içine hibridizasyon tampon eksi ve hibridizasyon tampon artı aliquots yerleştirin. Tüm dokuların tamamen çözeltiyle kaplı olmasını sağlayan embriyo şişelerine hazırlanmış bir PK çözeltisi ekleyin. Şişeleri bir platform çalkalayıcıya aktarın ve proteinaz K çalışma çözeltisinde yaklaşık 12 dakika sindirin.Bundan sonra, pk çözeltisini yavaşça çekin ve kalan PK'yı seyreltmek için şişeyi PBT ile birlikte kısa bir süreliğine sulayın. PBT çözeltisini 500 mikrolitre taze PBT ile değiştirin ve çözeltinin platform çalkalayıcısında beş dakika durulanmasına izin verin. Daha sonra PBT çözeltisini 500 mikrolitre çözülmüş %4 PFA ile değiştirin. Embriyolar 20 dakika oda sıcaklığında platform shaker üzerinde kuluçka yaslayın.Ön hibridizasyona başlamak için, embriyo içeren şişelere 500 mikrolitre önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon eksi çözeltisi ekleyin. Beş dakika boyunca sallayarak olmadan 70 santigrat derece su banyosunda conta içine şişeleri dikkatlice yerleştirin. Sonraki hibridizasyon tampon eksi çözüm kapalı çekmek ve önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon artı çözüm 500 mikrolitre ile şişeleri sel.Su banyosunda conta içine şişeleri geri yerleştirin ve dört saat ya da bir gecede sallayarak kuluçka. Hibridizasyon abaşlamak için, şişeler dışında hibridizasyon tampon artı çizmek ve taze önceden ısıtılmış hibridizasyon tampon artı 500 mikrolitre ile değiştirin. Her şişeye iki mikrolitre RNA sondası ekleyin ve sondanın eşit dağılımını sağlamak için yavaşça girdap layın.40 RPM sallayarak bir gecede 70 santigrat derece su banyosunda kuluçka. Başlamak için, mikrosantrifüj tüpleri hibridizasyon tampon artı ilgi RNA prob geni ile metin protokolünde belirtildiği gibi etiketli hazırlamak. İki adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve 0,2 gram bloke reaktifi ve 10 mililitre MABT ekleyin.Reaktif çözeltide tamamen eriyene kadar her iki tüpü de bir besleyici mikser üzerine yerleştirin. Bir cam Pasteur pipet kullanarak hibridizasyon tampon artı ve prob çözeltisi çizmek ve steril etiketli mikrosantrifüj tüp içine yerleştirin. Bu tüpü ileride kullanılmak üzere eksi 20 derecede dondurucuda saklayın.Dikkatle sıcak tuzlu sodyum sitrat ve hibridizasyon tampon eksi seyreltme 500 mikrolitre ekleyin. Her biri sallayarak su banyosunda 10'er dakika sıralı çözeltiler halinde kuluçkaya yatırın ve metin protokolünde belirtildiği gibi bir platform çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında. Son kuluçkadan sonra, her şişedeki %100 PBT'yi 500 mikrolitre MABT ile değiştirin.Bu işlemi her biri beş dakika boyunca iki kez tekrarlayın. İlk olarak, her şişeden MABT çıkarın ve 15 mililitrelik konik tüpler birinden önceden karışık engelleme çözeltisi ile sel. Oda sıcaklığında dört saat boyunca besleyici karıştırıcı üzerine her iki şişe yerleştirin.Hazırlanan bloklama çözeltisi ve kısaca girdap ikinci tüp antikor parçaları iki mikrolitre ekleyin. Sonra engelleme çözeltisi ile neredeyse tamamen her şişe doldurun ve dört derece santigrat bir buzdolabında bir gecede bir nutating karıştırıcı üzerine yerleştirin. Başlamak için, MABT%10 NGS'lik bir stok şişesi hazırlayın.Her şişedeki engelleme çözeltisini bu NGS çözeltisinin 500 mikrolitresi ile değiştirin. Platform shaker oda sıcaklığında 25 dakika kuluçka. Bundan sonra NGS karışımını %100 MABT'nin 500 mikrolitresiyle değiştirin.30 dakika boyunca oda sıcaklığında platform shaker incubate. Bu durulayın 11 gün boyunca, her 30 dakikada bir daha. Sonra% 100 MABT ile her şişe doldurun ve dört derece santigrat bir buzdolabında bir gecede bir besleyici karıştırıcı üzerine yerleştirin.İlk olarak, her şişedeki MABT'yi bir mililitre AP tamponuyla değiştirin ve beş dakika boyunca yıkamasına izin verin. MABT'yi tamamen kaldırmak için bu yıkamayı iki kez tekrarlayın. Daha sonra AP tamponu, 3,5 mikrolitre BCIP ve 4,5 mikrolitre MBT içeren bir mililitre taze AP tamponu ile değiştirin.Reaksiyon tamamlanana kadar her saat başı BCIP ve MBT içeren yeni bir AP tampon karışımı yla değiştirin, reaksiyonu yakından izlediğinden ve istenilen boyama düzeyielde edilene kadar her 15 dakikada bir kontrol ettiğinizden emin olun. Protokolde belirtildiği gibi AP tamponunda 1X PBT konsantrasyonu artan bir konsantrasyonda embriyoları durulayarak renklenme reaksiyonunu durdurun. İstenilen minimum arka plan boyama ulaşına kadar bir besleyici karıştırıcı üzerinde yaklaşık beş mililitre% 100 PBT embriyolar durular.Durulama tamamlandığında, embriyoları 500 mikrolitre steril PBS'de bir platform çalkalayıcı üzerinde yıkayın ve metin protokolünde belirtildiği gibi örnekleri postfix. Embriyoları duruladıktan sonra, %100 steril PBS'nin dört mililitreye yerleştirin ve gerekirse uzun süreli olarak dört santigrat derecede saklayın. Bu çalışmada embriyonik Astyanax örnekleri yüksek kaliteli gen ekspresyonu analizi için etiketlenmiştir.Bu süreç hem Pachon mağara balığı hem de yüzey balığı embriyolarında başarıyla uygulanmıştır. Sox9 ekspresyonu için etiketlenmiş mağara balığı embriyoları, gelişmekte olan dalsal kemerlerde ve pektoral yüzgeçlerde açık etiketleme göstermektedir. Boyama nın sarısı kesesinde veya yan tarafta gelişen somitlerde neredeyse yok olduğunu unutmayın.Benzer şekilde, Tfap2a ekspresyonu embriyonun dorsal böğür bölgesi boyunca erken göç nöral krest hücreleri olarak gelişmekte olan baş ın bölümlerinde belirgindir. Mağara balığı embriyoları phf20a için sunulan üçüncü gen, kemik dokusuna yol açan somatik mezoderm ve posterior baş bölümlerinde görülür. CXCR için etiketlenmiş yüzey balık embriyoları baş ve kanadın izole bölgelerinde pozitif etiketleme göstermek, yanı sıra sarısı kesesini örten birkaç bireysel hücreler.Adcyap1a geni hipofiz hücreleri de dahil olmak üzere merkezi sinir sisteminin bölgelerinde ifade edilir. Embriyonun dorsal yönü üzerinde eşleştirilmiş hücre çiftleri içinde yüksek özgüifade, hem de orta hat ifade daha büyük bir bölge unutmayın. Mağara balığı embriyoları için incelenen son gen olan Sox10, dorsal embriyonun sol ve sağ taraflarında nöral tepenin erken bir belirteci olarak belirgindir.Situ'u tamamladıktan sonra, genellikle Sonuçlarımızı ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyiz. Boyama bozulmasını önlemek için tamamlanmasından sonra iki hafta içinde bunu yapmak en iyisidir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Developmental Biology

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Evolution

Evolutionary History

SCIENTISTS IN ACTION

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Understanding Early Organogenesis Using a Simplified In Situ Hybridization Protocol in Xenopus

Anlamak Basitleştirilmiş kullanma Erken Organogenez<em&gt; In Situ</emIçinde&gt; Hibridizasyon Protokolü<em&gt; Ksenopus</em

Organogenesis is the study of how organs are specified and then acquire their specific shape and functions during development.  The Xenopuslaevis embryo ...

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Multi-target Chromogenic Whole-mount In Situ Hybridization for Comparing Gene Expression Domains in Drosophila Embryos

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

To analyze gene regulatory networks active during embryonic development and organogenesis it is essential to precisely define how the different genes are ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH to Monitor the State of Arm Cohesion in Prometaphase and Metaphase I Drosophila Oocytes

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

In humans, chromosome segregation errors in oocytes are responsible for the majority of miscarriages and birth defects. Moreover, as women age, their risk ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Genotyping and Quantification of In Situ Hybridization Staining in Zebrafish

Zebrabalığında Situ Hibridizasyon Boyamada Genotibrasyon ve Nicelik

In situ hybridization (ISH) is an important technique that enables researchers to study mRNA distribution in situ and has been a critical technique in ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Zebrabalığı Embriyolarında Situ Hibridizasyon ve IPSC-EC'lerde Tüp Oluşumu Nda Endoglin'in Vasküler Gelişimdeki Rolünü İncelemek İçin Tam Montaj

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Xenopus laevis'te Nöronal Öncül Karakterizasyonu için Floresan Kalsiyum Görüntüleme ve Daha Sonra Yerinde Hibridizasyon

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Incremental Temperature Changes for Maximal Breeding and Spawning in Astyanax mexicanus

Astyanax mexicanus'ta Maksimal Üreme ve Yumurtlama için Artımlı Sıcaklık Değişiklikleri

The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, is an emerging model system for studies in development and evolution. The existence of eyed surface (surface fish) ...