Name: agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

这项工作得到了 innovo y Ciencia 部长 (AGL2009-13745, FPI 向 PB 提供的赠款)、经济和竞争事务部的赠款和 FEDER 的资助 (AGLUS-36725, AGL2015-675-C2-R) 和 Girona 大学 (向 SF 提供博士补助金, 并向 sf 提供博士赠款)单一/)。提交人感谢 Inge Broer 博士 (德国罗斯托克大学土地使用研究所) 和 Saloméprat 博士 (西班牙马德里国家生物技术中心) 提供了 a. Rhizogenes 和a. tumefaciens 菌株,并提供了 Marçal Soler 博士和 Anna Plasencia 博士在启动a.根瘤菌转化实验方面得到的帮助和支持 (Toulouse III Paul Sabatier 大学-CNRS, 植物研究实验室, Castanet tolosan,法国)。作者感谢 Sara Gómez (UdG、Girona 的 Biologia 省、Girona) 在开展实验室工作和照料植物方面提供的宝贵协助, 并感谢 Ferran Fontdecaba 和 Carla Sánchez 在进行一些实验时提供了协助。他们的最终学位项目。

从 Horn 等人的研究中对 a. 根瘤菌转化协议进行了调整和修改, 所测试的基因型为块茎.对 Banerjee 等人进行了 a. tumefaciens 转化协议的改编和修改, 所测试的基因型为块茎菌(Cv. désirée)和刺五加. 图1和图 2分别总结了这两个过程的主要步骤。
请注意:在进行体外<...

在马铃薯中, 获得稳定完整转基因植物的最常见系统使用农杆菌菌株的转化, 这些菌株需要利用外源植物激素进行器官生成。尽管基于农杆菌的协议有可能整合非 t-dna 载体序列 25, 但这种方法仍然是最简单、成本更低的方法, 可以改造马铃薯植物。在过去的几年里, 人们对a. 根瘤菌介导的转化的兴趣引起了研究人员的关注, 因为它允许在比使用a. 肿瘤更短...

除了经济利益, 转基因植物的产生有其自身的相关性, 在研究中可以证明基因的最终功能, 并更好地了解植物的生理和发育。植物 DNA 插入最广泛使用的方法是农杆菌介导的转化。农杆菌通过其诱导肿瘤 (ti) 质粒的作用, 能够在许多植物物种的受感染组织中产生冠状凝块。质粒包含一个 t-dna 区域, 具有一组基因, 这些基因将被整合到植物基因组中, 并诱导组织去分化 1,2。转基因在 T-DNA 内交换这些基因, 使植物进行了特定的修饰, 避免了表型效应3。为了促进对 T-DNA 的转基因克隆, T-DNA 区域在一个称为二元质粒的独立质粒中被切除, 而 Ti 质粒 (允许 T-DNA 转移和插入机制的毒力基因) 的其余基因则被切除。放置在辅助质粒中。对于植物生物技术研究来说, 由a. tumefaciens进行改造有几个优点: 它不需要昂贵的设备, 能够产生稳定和短暂的植物转化, 并且将少量的基因副本集成到4号染色体.然而, 对于大多数植物, 但不是拟南芥,建立稳定的转化物需要植物再生从一个单一或几个细胞使用外源植物激素, 使这一过程费力和耗时。根瘤菌也能够改变植物基因组, 产生毛茸茸的根或不定根在感染部位由于表达的滚动(根位点) 基因编码在根诱导 (ri) 质粒 5.虽然研究较少, 但根瘤菌也被用于获得转基因根。在这种情况下, a. 根瘤菌在 ri 质粒中含有原始的 t-dna, 并在二元质粒中含有第二个携带转基因的 t-dna。当感染部位在茎或下胚轴时, 可以获得一种复合植物, 新的多毛转基因根从野生类型的芽中出现。另外, 毛状转化的根可以在有碳源输入的培养基中在体外自主生长。当根是靶器官时, 使用根质体而不是肿瘤产生转基因组织的方法正在变得越来越重要, 因为不需要植物再生, 因此它的速度更快, 成本更低。以往的研究已经证明了这种方法, 用于根特异性基因的表型表征 6,7,8,9。
根据联合国粮食及农业组织 (FAO) 的数据, 马铃薯(Solanum tuberom而d) 是世界上第四大最重要的作物, 因为块茎作为维生素的良好来源, 对人类消费具有营养意义和矿物。因此, 马铃薯已成为农业生物技术的焦点, 也被认为是遗传和发展研究的良好生物模式10、11.马铃薯转化通过对亚素和蜡生物合成所涉及的基因的表征, 对亚化组织的分子机制有显著的贡献, 12、13、14 ,15,16, 17, 亚素单体运输18和转录条例19。亚铁蛋白烯基转移酶基因Fht是这些具有特征的生物合成基因之一;其下调对表皮保护的影响很大, 这与马铃薯块茎14中的亚、酸和蜡的发酵酯率大幅下降有关。此外, 在拟南芥的根部和种子中, 其假定的正位词 (asft/rwp1) 的敲除也证明了其在亚、核素20、21中生成烷基发酵的作用。在马铃薯中, Fht转录记者行和 FHT 抗体分别表明启动子活性和蛋白质分别位于外皮、内皮、phellogn 衍生物和受伤组织15。
在这项工作中, 我们详细介绍了一个协议, 使用a. 根瘤菌生产转基因毛状根, 保存在野生类型的芽, 产生复合马铃薯植物, 或切除在体外自主生长。我们还提供了使用a. tumefaciens获得完整转基因马铃薯植物的协议。作为一个案例研究, 用相同的二元载体转化的a. 根瘤菌和a. tumefaciens 被用来获得根系与fht启动子驱动 gus 记者基因的表达。报告并比较结果。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="559">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1.310.071.21
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetosyringone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Acros
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			115540050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Aquarium pump
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Prodac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			MP350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Autoclave
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Ragpa Strelimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Bacteriological agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1800
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			BAP
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			B0904
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:20px;">
			Beef extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:20px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:20px;">
			1700
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant growing cabinet
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Nuaire
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Carbenicillin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0109
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Cefotaxime sodium
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0111
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			DMSO
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1029310161
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ecotron infors
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			HT
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			29378
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1,009,831,011
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Falcon tube
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Control tecnica
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			CFT011500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferricyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			101001081
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferrocyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			100979088
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Apiglass
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			ref16
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			GA3
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G7645
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gamborg B5 media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G0210
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gelrite
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G1101
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Glucosa
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G5767
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Kanamycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			K1377
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Leukopor tape
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			BSN Leukopor
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			BDF47467
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Lupe
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Wild-Heerbrugg
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M420
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Magnetic shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Agimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			7000243
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MES hydrate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M2933-25G
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MgSO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131404
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Microscope
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Minufugue centrifugue 5415R
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Murashige and Skoog media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M0254.0050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Na2HPO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131679
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NAA
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			N0903
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaCl
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131659
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaH2PO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			58282
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NightSea Stereo
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			SFA Moonting Adapter
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Parafilm
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			PRFL-001-001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Peptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1616
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Petri dishes (90 x 14)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			pHmetre
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Crison
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Phytotron
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Inkoa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			RFTI-R5485
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant Agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			P1001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Refrigeratot
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Liebherr Medline
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Rifampicin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			R0146
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectinomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			59007
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectrophotometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Shimadzu
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Square plates (120 x 120)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Deltalab
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			S6501
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:22px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:161px;height:22px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:22px;">
			131621
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical blades
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Swann-Morton
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			201
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical needle
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			NIPRO
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			015/0204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1612
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triton
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Serva
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			37240
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Unimax 1010 shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Heidolph
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Vacuum
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Dinko
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Biosynth
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			B-7398
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Yeast extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1702.00
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Zeatin riboside
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1001042850
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining

农杆菌是获得转基因植物最广泛使用的方法之一, 因为它有能力将自己的 t-dna 转移并整合到植物的基因组中。在这里, 我们提出了两个转化系统, 基因改造马铃薯 (刺过木豆)植物。在肿瘤转化过程中, 叶子被感染, 转化后的细胞被选择, 一个新的完整的转化植物在18周内被再生。在根瘤菌转化过程中, 茎通过注射针头感染细菌, 用红色荧光标记检测新出现的转化的多毛根, 去除未转化的根。在5-6 内, 所产生的植物是一种野生类型的芽的组合, 具有完全发育的转化的毛状根。为了增加生物量, 转化后的毛状根系可以被切除和自我繁殖。我们应用这两种农杆菌介导的转化方法来获得根系表达 gus 记者基因驱动的亚素生物合成基因启动子。提供 GUS 染色程序, 并允许细胞定位的启动子诱导。在这两种方法中, 转化后的马铃薯根系在亚皮内皮和外真皮中都显示了 GUS 染色, 此外,在 a. 根瘤菌转化的根系中, 在侧根的出现中也检测到了 gus 活性。这些结果表明, a. 根瘤菌可以成为研究根系中表达的基因的快速替代工具。

根瘤菌-介导的马铃薯转化
在这篇手稿中, 提出了逐步建立的程序, 以获得转化根与 a. 根瘤菌。图 1概述了该过程, 总共需要大约 5-6 (从注射a. 根瘤菌到获得完全发育的多毛根)。然后, 该植物可以作为一种复合 (野生类型的芽, 转基因根) 或转基因毛状根克隆可以...

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Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

农杆菌和根瘤菌--马铃薯介导的马铃薯转化与葡萄染色诱导素基因的启动子活性

在这里, 我们提出了两个协议, 以改造马铃薯植物。农杆菌的转化导致一个完整的转基因植物, 而农杆菌根状茎产生转基因毛状根在野生类型的芽, 可以自我繁殖。然后, 我们通过 GUS 染色检测转化根系中的启动子活性。

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

农业细菌转化是生产转基因马铃薯植物的一种简单方法。为了了解特定的基因功能及其对器官生理学的贡献。农业细菌根质转化是快速评估基因功能根的一个有力工具，因为农业细菌的转化可以取得类似的结果。演示这个程序的将是桑德拉·费尔南德斯-皮南，博士后，和詹妮弗·洛佩兹，一个桅杆5r的学生从我们的实验室。首先在5毫升酵母提取物汤（YEB培养剂）中隔夜种植单个农业菌群，在28摄氏度的50毫升离心管中补充抗生素，每分钟旋转200次。对于一个 tumefaciens 的变换，请第二天早上测量光学密度。当600纳米或OD 600的光学密度达到0.6至1时，将一毫升的农业细菌培养物离心，将颗粒重新在一毫升新鲜YEB介质中，无需抗生素。第二次洗涤后，在没有抗生素的新鲜YEB介质中重新暂停颗粒，以适当的浓度获得最终OD 600的0.8，并将细菌细胞放在冰上。对于使用 A.rhizogenes 进行植物转化，请小心地将供体植物从 2MS 中等培养体转移到 120 乘 120 毫米的方形板，并使用手术针将来自 A.rhyzogenes 培养的三微升注射到不同的茎内皮。然后立即将整个植物转移到一个新的方形板，其中包含固体MS介质，辅以0.1毫摩尔乙酰西林酮。将第二个植物放在同一个板上后，以相同方式进行转化，用手术胶带密封板，并将板垂直放置在生长柜内四天。将植物转移到含有MS介质的方形板中，并辅以cefotaxime钠，杀死A.rhizogenes，将密封板垂直放在生长柜内四天。10到12天后，新的毛根会出现。它们的转化可以通过荧光立体显微镜得到确认。此时，切除每株植物的原生根，将植物转移到一个新的方形板与MS介质，辅以cefotaxime钠杀死A.rhizogenes。为了获得复合植物，让转基因毛根在MS介质中再生长三到四周，辅以cefotaxime钠。用于使用 A.tumefaciens 进行植物改造。在培养皿中切割和放置一个三到四周大的植物的叶子，并使用手术刀将一到三个横向切口从叶子的中心切到边缘，而不切掉叶子的碎片。并排除小动物。立即将叶子放入含有 10 毫升新鲜 2MS 液体介质的培养皿中，向上加面，并盖住盘子。快速将 80 微升的 A.tumefaciens 培养剂添加到液体介质中，轻轻搅拌介质一分钟，以均匀分布细菌溶液。然后用铝箔小心地密封并盖上板，在24摄氏度的室内进行为期两天的孵育。在转换期结束时，将叶子的叶面向上，转移到无情的诱导介质上，用钳子刮在生长柜中孵育一周。在孵育结束时，将叶子，轴侧向上，转移到钳子刮的射射诱导介质上，并在生长柜中孵育叶子。当出现的滑道大约两厘米高时，从每个无情的滑道上切出三个新兴的滑道。将多达五个不同的滑道转化事件放入含有MG介质的单独培养瓶中，并辅以cefotaxime钠，并适当标记该子集，在生长柜中孵育三到四周，直到滑道充满活力。在孵化结束时，选择每个事件中最具活力的植物，并切开滑道的各处，从每个植物中切开三到四个内极。将片段放入含有 2MS 介质的培养瓶中，并辅以 cefotaxime 钠，然后种植植物，直到它们形成充满活力的滑道和根。要进行β-葡萄糖素酶或GUS组织化学记者基因测定，用90%冷冻丙酮在冰上2至3周的体外植物培养物固定根部。在固定结束时，用蒸馏水洗两次根部，并在真空下用新鲜的GUS染色溶液处理根部20分钟。在真空处理结束时，将根部在37摄氏度的黑暗中放置约4小时。当蓝色可见时，用70%乙醇洗两次根部，并在明亮的现场显微镜下显示染色。变变的毛质根在绿灯照射时表现出红色荧光，而负控制未转化的农业细菌则没有这种荧光，表明 DS 红色转化标记是否适合识别转基因毛质根。在这里，显示由 A.tumefaciens 获得的转基因植物根部和 A.rhizogenes 获得的转基因毛根的 GUS 染色。正如观察到的，根随着 A、tumefaciens 和体外生长而转化，在内皮层和骨骼之间的细胞层中表现出蓝色染色。在更发达的根中，蓝色标记在外部层中是零碎的，与外显层相对应。在由 A.rhizogenes 获得的转化毛根中，在水培中生长，GUS 标记特别位于内皮内皮内，在受伤区域和外皮中出现横向根。除了快速的方法外，用农业细菌根质获得的转基因根也携带来自根诱导质粒的DNA，这可能解除一些直接控制过程的调节。用农业细菌根质获得的转基因毛根可以在它们拍摄时保持，但也可以在现场，直到在体外繁殖，进行大规模的过境生产。马铃薯转化为检查基因功能和启动子的活化提供了很好的工具，也为高农艺兴趣物种提供了方法规则。转基因生物使用后应安全丢弃，以避免环境污染。此外，气体溶液含有有毒的氰化物衍生物，因此请进行耐磨保护并安全丢弃溶液。

Research

JoVE Journal

Environment

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

在使用高通量微孔板测定水，土壤，沉积物和微生物测定胞外酶活性的

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科研

环境科学

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