Name: agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Dette arbejde blev støttet af Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI tilskud til PB), Ministerio de Economía y Competitividad og FEDER finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) og universitetet i Girona (Ph.d.-stipendium til SF og tilskud SING11/1). Forfatterne er taknemmelig for, at Dr. Inge Broer (Institut for arealanvendelse, Universitet i Rostock, Rostock, Tyskland) og Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) for at give A. rhizogenes og A. tumefaciens stamme, henholdsvis, og Dr. Marçal Soler og Dr. Anna Plasencia for den hjælp og støtte modtaget i indledningen A. rhizogenes transformation eksperimenter (Toulouse III Paul Sabatier Universitet — CNRS, plante Research Laboratory (LRSV), Castanet-Tolosan Frankrig). Forfatterne takke Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) for hendes værdifulde bistand i udførelsen af laboratoriearbejde og pasning af planter, og Ferran Fontdecaba og Carla Sánchez der bistået med nogle af eksperimenterne, mens de gjorde deres endelige grad projekter.

A. rhizogenes transformation protokol blev tilpasset og ændret fra Horn et al.7 og genotype testet var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens transformation protokol blev tilpasset og ændret fra Banerjee et al.22 og genotyper testet blev S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) og S. tuberosum ssp. andigena. De vigtigste trin i begge procedurers er sammenfattet i figur ...

I kartoffel bruger de mest almindelige system at opnå stabile komplet transgene planter omdannelsen af Agrobacterium tumefaciens stammer, der kræver organogenesis ved hjælp af eksogene Phytohormoner. Selv om protokollerne Agrobacterium baseret har potentiale til at integrere ikke-T-DNA vektor sekvens25, er denne metode stadig den letteste og mindre dyre tilgængelige at omdanne kartoffelplanter. I løbet af sidste år, interesse i A. rhizogenes-medieret transformation...

Bortset fra økonomiske interesse har generation af transgene planter sin egen relevans i forskning at vise den ultimative funktionen af gener og bedre forstå plantefysiologi og udvikling. Mest udbredte metode til plante DNA indsættelse er Agrobacterium-medieret transformation. Agrobacterium tumefaciens er i stand til at generere crown galls i det inficerede væv af mange plantearter ved hjælp af dens tumor-overtalelse (Ti) plasmid. Plasmidet indeholder en T-DNA region med et sæt af gener, der vil blive integreret i anlægget genom og fremkalde væv dedifferentiation1,2. Udvekslingen af disse gener inden for T-DNA af transgenet har tilladt generation af specifikke anlæg ændringer undgå fænotypisk virkninger3. For at lette transgenet kloning ind i T-DNA, T-DNA-regionen har været skåret ud i en uafhængig plasmid kaldet en binær plasmid, mens resten af gener for Ti-plasmidet (virulens gener, der giver mulighed for T-DNA overførsel og indsættelse mekanismer) har været placeret i en helper plasmid. For plante bioteknologi forskning, transformation af A. tumefaciens har flere fordele: det behøver ikke dyre enheder, er i stand til at generere både stabile og forbigående plante transformation og lavt antal gen kopier er integreret i den kromosom4. Men for de fleste planter, men ikke Arabidopsis, generation af stabile transformants kræver planten regenerering fra en enkelt eller et par celler ved hjælp af eksogene Phytohormoner, hvilket gør denne proces, besværlige og tidskrævende. A. rhizogenes er også i stand til Rediger genomet plante producerer behårede rødder eller utilsigtet rødder på infektion steder på grund af udtryk af rol (root loci) gener kodet i root-inducerende (Ri) plasmid5. Selv om mindre undersøgt end A. tumefaciens, bruges A. rhizogenes også til at opnå transgene rødder. I dette tilfælde indeholder A. rhizogenes den oprindelige T-DNA i Ri plasmid og en binær plasmid med en anden T-DNA transporterer transgenet. Når webstedet infektion er i stængler eller hypocotyls, kan en sammensat plante fås, med nye behårede transgene rødder opstår fra vildtype skyder. Alternativt, behårede transformerede rødder kan vokse autonomt in vitro- medier med carbon source indgange. Brugen af A. rhizogenes i stedet for A. tumefaciens at producere transgene væv vinder relevans når roden er målorgan, fordi anlægget regenerering er ikke nødvendig og derfor er det hurtigere og billigere. Tidligere undersøgelser har vist denne metode tilegnet til fænotypisk karakterisering af roden specifikke gener6,7,8,9.
Kartoffel (Solanum tuberosum) er den fjerde vigtigste afgrøde i verden Ifølge Levnedsmiddel- og Landbrugsorganisation af de Forenede Nationer (FAO), da knolden ernæringsmæssig relevans til konsum for at være en god kilde til vitaminer og mineraler. Derfor, kartoffel er blevet placeret i søgelyset for landbrugs bioteknologi og også betragtes som en god biologisk model for genetiske og udviklingsmæssige undersøgelser10,11. Kartoffel transformation bidraget væsentligt til forståelsen af molekylære mekanismer underliggende korkagtige væv gennem karakterisering af gener involveret i suberin og voks biosyntesen12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 og transskription forordning19. Suberin feruloyl-transferase-genet, FHT, er en af disse karakteriseret biosyntetiske gener; dens downregulation giver anledning til en stærk forringelse af periderm beskyttelse, som er korreleret med en stærk nedgang i ferulate estere af suberin og voks i kartoffel knolde14. Samtidig, i rødder og frø af Arabidopsis demonstreret knockout af dens formodede orthologue (ASFT/RWP1) også sin rolle i at producere alkyl ferulates i suberin20,21. I kartoffel viste FHT transcriptional reporter linje og FHT antistof henholdsvis at promotor aktivitet og protein er placeret i exodermis, endodermis, phellogen-derivater og sårede væv15.
I dette arbejde detalje vi en protokol bruger A. rhizogenes til at producere transgene behårede rødder, der vedligeholdes i en vildtype skyde, generere sammensatte kartoffelplanter eller skåret ud til at vokse autonomt in vitro. Vi leverer også protokollen ved hjælp af A. tumefaciens for at opnå komplet transgene kartofler. Som case bruges A. rhizogenes og A. tumefaciens omdannet med den samme binære vektor til at få rødder med FHT promotor kørsel GUS reporter gen expression. Resultaterne indberettes og sammenlignet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="559">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1.310.071.21
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetosyringone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Acros
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			115540050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Aquarium pump
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Prodac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			MP350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Autoclave
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Ragpa Strelimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Bacteriological agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1800
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			BAP
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			B0904
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:20px;">
			Beef extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:20px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:20px;">
			1700
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant growing cabinet
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Nuaire
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Carbenicillin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0109
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Cefotaxime sodium
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0111
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			DMSO
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1029310161
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ecotron infors
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			HT
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			29378
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1,009,831,011
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Falcon tube
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Control tecnica
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			CFT011500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferricyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			101001081
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferrocyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			100979088
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Apiglass
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			ref16
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			GA3
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G7645
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gamborg B5 media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G0210
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gelrite
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G1101
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Glucosa
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G5767
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Kanamycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			K1377
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Leukopor tape
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			BSN Leukopor
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			BDF47467
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Lupe
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Wild-Heerbrugg
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M420
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Magnetic shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Agimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			7000243
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MES hydrate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M2933-25G
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MgSO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131404
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Microscope
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Minufugue centrifugue 5415R
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Murashige and Skoog media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M0254.0050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Na2HPO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131679
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NAA
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			N0903
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaCl
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131659
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaH2PO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			58282
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NightSea Stereo
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			SFA Moonting Adapter
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Parafilm
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			PRFL-001-001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Peptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1616
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Petri dishes (90 x 14)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			pHmetre
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Crison
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Phytotron
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Inkoa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			RFTI-R5485
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant Agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			P1001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Refrigeratot
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Liebherr Medline
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Rifampicin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			R0146
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectinomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			59007
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectrophotometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Shimadzu
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Square plates (120 x 120)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Deltalab
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			S6501
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:22px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:161px;height:22px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:22px;">
			131621
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical blades
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Swann-Morton
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			201
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical needle
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			NIPRO
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			015/0204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1612
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triton
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Serva
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			37240
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Unimax 1010 shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Heidolph
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Vacuum
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Dinko
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Biosynth
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			B-7398
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Yeast extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1702.00
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Zeatin riboside
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1001042850
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining

Agrobacterium sp. er en af de mest anvendte metoder til at opnå transgene planter, som det har evnen til at overføre og integrere sine egne T-DNA i plantens genom. Vi præsenterer her, to transformation systemer til genetisk ændre kartoffelplanter (Solanum tuberosum). I A. tumefaciens transformation, bladene er inficeret, de transformerede celler er markeret og en ny komplet transformerede anlæg er regenereres ved hjælp af Phytohormoner i 18 uger. I A. rhizogenes transformation, stængler er smittet ved at indsprøjte bakterier med en nål, de nye opstået transformerede behårede rødder er opdaget ved hjælp af en rød fluorescerende markør og ikke-transformeret rødderne er fjernet. I 5-6 uger er den deraf følgende anlægget sammensat af en vildtype skyde med fuldt udviklede transformerede behårede rødder. For at øge biomassen, kan de transformerede behårede rødder skåret ud og selv opformeret. Vi anvendte begge Agrobacterium -medieret transformation metoder for at opnå rødder udtrykker GUS reporter gen drevet af en suberin biosyntetiske gen promotor. GUS farvnings-procedure er fastsat og tillader celle lokalisering af promotor induktion. I begge metoder viste de transformerede kartoffel rødder GUS farvning i korkagtige endodermis og exodermis, og derudover i A. rhizogenes omdannet rødder GUS aktivitet blev også fundet i fremkomsten af laterale rødder. Disse resultater tyder på, at A. rhizogenes kan være en hurtigt alternative redskab til at studere de gener, der udtrykkes i rødder.

Agrobacterium rhizogenes -medieret kartoffel transformation
I dette manuskript præsenteres den trinvise procedure sat op til at få transformeret rod med A. rhizogenes . Figur 1 viser en oversigt over den procedure, som helt tager ca 5-6 uger (fra injektion af A. rhizogenes at opnå fuldt udviklede behårede rødder). Derefter kan anlægg...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens og Agrobacterium rhizogenes-medieret Transformation af kartoffel og promotor aktivitet af en Suberin gen af GUS Staining

Vi præsenterer her, to protokoller for at omdanne kartoffelplanter. Agrobacterium tumefaciens transformation fører til et komplet transgene anlæg mens Agrobacterium rhizogenes producerer transgene behårede rødder i en vildtype skyde, der kan være selvstændige opformeret. Vi registrerer promotor aktivitet af GUS farvning i de transformerede rødder.

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Den agrobacterium-medieret transformation er en nem metode til fremstilling af genetisk modificerede kartoffelplanter. For at forstå specifikke genfunktioner og deres bidrag til organfysiologi. Transformation ved agrobacterium rhizogener er et robust værktøj til hurtigt at vurdere genfunktionerende rødder, da lignende resultater kan opnås ved agrobacterium tumefaciens transformation.Demonstrere denne procedure vil være Sandra Fernandez-Pinan, en post-doc, og Jennifer Lopez, en maste5r studerende fra vores laboratorium. Begynd med at dyrke en enkelt agrobakterier koloni natten over i fem milliliter gær ekstrakt bouillon, eller YEB medium, suppleret med antibiotika i en 50 milliliter centrifuge rør ved 28 grader Celsius, ved 200 rotationer i minuttet. For a-tumefaciens transformation, måle den optiske tæthed næste morgen.Når den optiske massetæthed ved 600 nanometer, eller OD 600 når 0,6 til en, centrifuge en milliliter af agrobakterier kultur og resuspend pellet i en milliliter frisk YEB medium uden antibiotika. Efter den anden vask, resuspend pellet i frisk YEB medium uden antibiotika, til passende koncentration for at opnå en endelig OD 600 af 0,8, og placere bakterieceller på is. For plante transformation ved hjælp af A.rhizogener, omhyggeligt overføre en donor plante fra en 2MS medium kultur til en 120 af 120 millimeter kvadratisk plade, og bruge en kirurgisk nål til at injicere tre mikroliter fra en A.rhyzogenes kultur til forskellige stilk internoder som muligt.Derefter overføres hele planten straks til en ny kvadratplade indeholdende fast MS-medium, suppleret med 0,1 millimolar acetosyringone. Efter at placere en anden plante på samme plade, omdannet på samme måde, forsegle pladen med kirurgisk tape, og placere pladen lodret inde i et vækstkabinet i fire dage. Overfør planten til en firkantet plade med MS medium suppleret med cefotaxime natrium til at dræbe A.rhizogener og placere den forseglede plade lodret inde i et vækstkabinet i fire dage.Efter 10 til 12 dage, nye behårede rødder vises. Deres transformation kan bekræftes af fluorescerende stereomikroskop. På dette tidspunkt, punktafgifter de indfødte rødder af hver plante, og overføre planterne til en ny firkantet plade med MS medium, suppleret med cefotaxime natrium til at dræbe A.rhizogener.For at opnå en sammensat plante, lad de transgene behårede rødder vokse i yderligere tre til fire uger i MS medium, suppleret med cefotaxime natrium. Til plantetransformation ved hjælp af A.tumefaciens. Skær og placere et blad fra en tre til fire uger gammel plante i en petriskål, og bruge en skalpel til at gøre en til tre tværgående nedskæringer fra midten af bladet til kanterne uden at skære stykkerne ud af bladet.og for at udelukke stilken. Bladret umiddelbart i en petriskål med 10 milliliter frisk 2MS flydende medium, abaxial side op, og dæk pladen til. Tilsæt hurtigt 80 mikroliter af A.tumefaciens-kulturen til det flydende medium, og rør forsigtigt mediet i et minut for at fordele bakterieopløsningen homogent.Derefter forsigtigt forsegle og dække pladen med aluminiumsfolie til en to-dages inkubation i en 24-graders Celsius kammer. Ved afslutningen af transformationsperioden overføres bladene abaxial-side op til det afstøbte medium, skrabet med en pincet til en uges inkubation i vækstkabinettet. Ved udgangen af inkubationen, overføre bladene, abaxial-side op, på en pincet-skrabet skyde inducerende medium, og inkubere bladene i en vækst kabinet.Når de viste faldskærme er omkring to centimeter høj, skære tre nye faldskærme fra hver afstumpede. Placer op til fem forskellige chute transformation begivenheder i individuelle kultur kolber, der indeholder MG medium suppleret med cefotaxime natrium til at tillade rode, og mærke understuben efter behov for en tre til fire ugers inkubation i vækstskabet, indtil faldskærmene er kraftige. I slutningen af inkubationen skal du vælge den mest energiske plante af hver begivenhed og skære de apikale segmenter af slidsken med tre til fire internoder fra hvert anlæg.Segmenterne anbringes i en dyrkrede kolbe indeholdende 2MS-medium suppleret med cefotaximenatrium, og planterne dyrkes, indtil de udvikler kraftige rutsjebaner og rødder. For at udføre en beta-glucuronidase eller GUS histokemiske reporter genanalyse, fastsætte rødderne fra en to til tre uger in vitro plante kultur med 90% kølet acetone i 20 minutter på is. Ved afslutningen af fikseringen vaskes rødderne to gange i destilleret vand, og rødderne behandles med frisk GUS-farvningsopløsning under vakuum i 20 minutter.Ved afslutningen af vakuumbehandlingen skal rødderne placeres ved 37 grader Celsius i mørke i omkring fire timer. Når en blå farve er synlig, vaske rødderne to gange med 70% ethanol, og visualisere farvning under et lyst felt mikroskop. Transformerede behårede rødder udviser en rød lysstof, når de belyses med grønt lys, mens negativ kontrol uoverformet agrobakterier ikke udviser en sådan florescence, hvilket indikerer egnetheden af DS rød transformation markør for at identificere transgene behårede rødder.Her vises GUS-farvning i rødder af transgene planter fremstillet af A.tumefaciens og transgene behårede rødder opnået af A.rhizogener. Som observeret, rødder omdannet med A, tumefaciens og dyrket in-vitro, demonstrere blå farvning i endodermis, et cellelag mellem cortex og stele. I mere udviklede rødder er den blå mærkning ujævn i det ydre lag, svarende til exodermis.I transformerede behårede rødder opnået ved A.rhizogener, og dyrket i hydroponics, GUS markør er specifikt placeret inden for endodermis i fremkomsten af laterale rødder i de sårede områder og i exodermis. Ud over at være en hurtig metode, de transgene rødder opnået med agrobacterium rhizogener også gennemført DNA fra rod-inducerende plasmid, som kan deregulere nogle direkte kontrollerede processer. De transgene behårede rødder opnået med agrobacterium rhizogener kan opretholdes, mens de skyder, men alternativt kan være på stedet, indtil formeret in vitro for massiv transit produktion.Kartoffeltransformationen er et godt værktøj til at kontrollere genfunktionen og promotoraktiveringen og også til at producere metodologiske regler i en art af høj agronomisk interesse. Den genetisk modificerede organisme bør kasseres sikkert efter brug for at undgå miljøforurening. Gasopløsning indeholder også giftigt cyanidderivat, så bær beskyttelse og kassér opløsningen sikkert.

Research

JoVE Journal

Environment

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestemmelse af Mikrobiel Extracellular enzymaktivitet i Vand, Jord og sediment ved hjælp af High Throughput Mikropladekrav Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimeret negativ farvning: en High-throughput protokol for behandlingen Små og asymmetrisk proteiners struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Forbigående genekspression i Tobacco hjælp Gibson forsamling og Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

Design og konstruktion af en Urban Afstrømning Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

En fisk-fodring Laboratory bioassay i vurdering af den Antipredatory aktivitet af sekundære metabolitter fra væv af marine organismer

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metode 1615. Måling af Enterovirus og Roskildesyge Forekomst i Water af Kultur og RT-qPCR. Del III. Virus Detection ved RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Geparder: Identifikation Personer ved deres fodspor

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Samtidig DNA-RNA-ekstraktion fra kystsedimenter og kvantificering af 16S rRNA-generne og udskrifter af Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empiriske, Metagenomic og beregningsmæssige teknikker belyse mekanismerne af som fungicider kompromis biers sundhed

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacle Balanus improvisus som en Marine Model - dyrkning og genekspression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...