Name: agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Diese Arbeit wurde von dem Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI Grant, PB), Ministerio de Economía y Competitividad und FEDER Mittel (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) und der Universität Girona (Promotionsstipendium an SF und Grant unterstützt. SING11/1). Die Autoren sind dankbar, dass Dr. Inge Broer (Institut für Landnutzung, Universität Rostock, Rostock, Deutschland) und Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) für die Bereitstellung der A. Rhizogenes und A. Tumefaciens Belastung, bzw., und Dr. Marçal Soler und Dr. Anna Plasencia für die Hilfe und Unterstützung bei der Einleitung von A. Rhizogenes Transformation Experimente (Toulouse III Universität Paul Sabatier-CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Kastagnetten eine (Frankreich). Die Autoren danken Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) für ihre wertvolle Unterstützung bei der Durchführung der Laborarbeit und die Betreuung der Pflanzen, und Ferran Fontdecaba und Carla Sánchez, die unterstützt mit einige der Experimente, während sie dabei waren Ihre endgültige Diplomarbeiten.

A. Rhizogenes Umwandlung Protokoll wurde angepasst und modifiziert von Horn Et Al.7 und der Genotyp getestet wurde S. Tuberosum Ssp. Tuberosum (CV Désirée). A. Tumefaciens Umwandlung Protokoll wurde angepasst und geändert von Banerjee Et Al.22 und die Genotypen getestet wurden S. Tuberosum Ssp. Tuberosum (CV Désirée) und S. Tuberosum SSP. Andigena. Die wichtigsten Schritte der beiden Verfahren sind...

In Kartoffel benutzt die häufigste System stabilere komplette transgene Pflanzen erhalten die Transformation durch Agrobacterium Tumefaciens Stämme, die Organogenese mit exogenen Phytohormone erfordern. Obwohl die Agrobacterium basierte Protokolle hat das Potenzial, T-DNA-Vektor Sequenz25zu integrieren, steht diese Methode immer noch die einfachste und weniger teuer Kartoffelpflanzen zu verwandeln. In letzten Jahren das Interesse an A. Rhizogenes-vermittelten Transform...

Abgesehen von wirtschaftlichem Interesse hat die Erzeugung transgener Pflanzen eine eigene Bedeutung in der Forschung, um die ultimative Funktion von Genen zu demonstrieren und Pflanzenphysiologie und Entwicklung besser zu verstehen. Die am weitesten verbreitete Methode, denn Pflanze DNA-Aufnahme Agrobakterium-vermittelten Transformation. Agrobacterium Tumefaciens ist Krone Galls in das infizierte Gewebe viele Pflanzenarten durch die Einwirkung von seiner Tumor-Induktion (Ti) Plasmid zu generieren. Das Plasmid enthält eine T-DNA Region mit einer Reihe von Genen, die in das pflanzliche Genom integriert werden und induzieren Gewebe Entdifferenzierung1,2. Der Austausch dieser Gene innerhalb der T-DNA durch das Transgen ermöglichte die Generation werksbezogen Modifikationen phänotypische Effekte3zu vermeiden. Um das Transgen in die T-DNA Klonen zu erleichtern, hat die T-DNA Region in eine unabhängige Plasmid bezeichnet eine binäre Plasmid, während der Rest der Gene der Ti-Plasmid herausgeschnitten worden gewesen sein (die Virulenz-Gene, die die T-DNA-Transfer und Einfügung Mechanismen erlauben) in einem Plasmid Helfer platziert. Für Pflanzenbiotechnologieforschung, Transformation von A. Tumefaciens hat mehrere Vorteile: es braucht keine teuren Geräte, erzeugen sowohl stabil und transiente Pflanzentransformation und niedrige Zahlen des Gens Kopien integriert sind die Chromosom4. Die Generation der stabile Transformanten erfordert jedoch für die meisten Pflanzen, aber nicht, Arabidopsis Pflanze Regeneration von einem oder wenigen Zellen mit exogenen Phytohormone, macht diesen Prozess mühsam und zeitaufwendig. A. Rhizogenes ist auch in der Lage, das Pflanzengenom ändern Herstellung behaarte Wurzeln oder zufällige Wurzeln an den Standorten der Infektion durch die Expression von Rol (Wurzel Loci) Genen kodiert in den Wurzel-induzierende (Ri) Plasmid5. Obwohl weniger als A. Tumefaciensstudiert, wird A. Rhizogenes auch verwendet, für den Erhalt der transgenen Wurzeln. In diesem Fall enthält die A. Rhizogenes die original T-DNA in das Plasmid Ri und eine binäre Plasmid mit einer zweiten T-DNA tragen das Transgen. Wenn der Infektionsstelle Stängel oder Hypocotyle ist, kann ein zusammengesetztes Werk mit neuen behaarte transgenen Wurzeln aus Wildtyp-Shootings erhalten. Alternativ können behaarte transformierte Wurzeln autonom in Vitro in Medien mit Kohlenstoff Quelle Eingänge wachsen. Die Verwendung von A. Rhizogenes anstelle von A. Tumefaciens , transgene Gewebe zu produzieren ist Relevanz gewinnt, wenn die Wurzel das Zielorgan, ist weil Pflanze Regeneration nicht erforderlich ist und daher es schneller und weniger kostspielig ist. Frühere Studien zeigten diese Methodik für die phänotypische Charakterisierung der Wurzel bestimmter Gene6,7,8,9angeeignet.
Die Kartoffel (Solanum Tuberosum) ist die viertwichtigste Kulturpflanze der Welt laut der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation der Vereinten Nationen (FAO) seit die Knolle ernährungsphysiologische Bedeutung für den menschlichen Verzehr als eine gute Quelle für Vitamine und Mineralien. Aus diesem Grund Kartoffel im Rampenlicht der landwirtschaftlichen Biotechnologie gelegt und gilt auch als ein gutes biologisches Modell für genetische und Entwicklungsbiologie10,11Studien. Kartoffel-Transformation trug wesentlich zum Verständnis der molekularen Mechanismen zugrunde liegenden suberized Gewebe durch die Charakterisierung von Genen beteiligt Suberin und Wachs Biosynthese12,13,14 ,15,16,17, Suberin Monomer Transport18 und Transkription Verordnung19. Das Suberin-Feruloyl-Transferase-gen, FHT, ist eines dieser charakterisiert biosynthetischen Gene; die Herunterregulierung gibt Anlass zu einer starken Beeinträchtigung des Schutzes Periderm, die mit einem starken Rückgang der ferulate Ester von Suberin und Wachse in Kartoffel Knollen14korreliert ist. Begleitend in Wurzeln und Samen von Arabidopsis zeigte der Ko von seiner vermeintlichen orthologs (ASFT/RWP1) auch seine Rolle in der Herstellung von Alkyl Ferulates Suberin20,21. In der Kartoffel zeigte die FHT transkriptionelle Reporter-Linie und der FHT-Antikörper bzw., dass die Promotoraktivität und das Protein in der Exodermis, die Endodermis der Phellogen-Derivate und verletzte Gewebe15befinden.
In dieser Arbeit zeigen wir ein Protokoll mit A. Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln produzieren, die in einem Wild-Typ-Shooting gepflegt sind, generiert composite Kartoffelpflanzen oder herausgeschnitten, um autonom in Vitrowachsen. Wir bieten auch das Protokoll mit A. Tumefaciens , um komplette transgenen Kartoffelpflanzen zu erhalten. Als Fallstudie werden A. Rhizogenes und A. Tumefaciens verwandelt mit der gleichen binären Vektor verwendet, um die Wurzeln mit dem FHT -Promotor fahren GUS -Reporter-gen-Expression zu erhalten. Die Ergebnisse sind gemeldet und verglichen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="559">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1.310.071.21
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetosyringone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Acros
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			115540050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Aquarium pump
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Prodac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			MP350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Autoclave
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Ragpa Strelimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Bacteriological agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1800
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			BAP
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			B0904
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:20px;">
			Beef extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:20px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:20px;">
			1700
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant growing cabinet
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Nuaire
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Carbenicillin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0109
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Cefotaxime sodium
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0111
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			DMSO
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1029310161
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ecotron infors
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			HT
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			29378
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1,009,831,011
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Falcon tube
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Control tecnica
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			CFT011500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferricyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			101001081
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferrocyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			100979088
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Apiglass
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			ref16
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			GA3
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G7645
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gamborg B5 media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G0210
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gelrite
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G1101
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Glucosa
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G5767
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Kanamycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			K1377
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Leukopor tape
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			BSN Leukopor
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			BDF47467
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Lupe
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Wild-Heerbrugg
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M420
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Magnetic shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Agimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			7000243
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MES hydrate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M2933-25G
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MgSO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131404
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Microscope
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Minufugue centrifugue 5415R
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Murashige and Skoog media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M0254.0050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Na2HPO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131679
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NAA
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			N0903
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaCl
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131659
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaH2PO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			58282
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NightSea Stereo
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			SFA Moonting Adapter
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Parafilm
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			PRFL-001-001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Peptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1616
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Petri dishes (90 x 14)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			pHmetre
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Crison
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Phytotron
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Inkoa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			RFTI-R5485
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant Agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			P1001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Refrigeratot
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Liebherr Medline
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Rifampicin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			R0146
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectinomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			59007
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectrophotometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Shimadzu
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Square plates (120 x 120)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Deltalab
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			S6501
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:22px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:161px;height:22px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:22px;">
			131621
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical blades
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Swann-Morton
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			201
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical needle
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			NIPRO
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			015/0204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1612
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triton
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Serva
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			37240
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Unimax 1010 shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Heidolph
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Vacuum
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Dinko
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Biosynth
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			B-7398
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Yeast extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1702.00
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Zeatin riboside
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1001042850
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining

Agrobakterium SP. gehört zu den am häufigsten verwendeten Methoden zu transgene Pflanzen zu erhalten, da es die Fähigkeit hat, zu übertragen und eine eigene T-DNA in das pflanzliche Genom zu integrieren. Hier präsentieren wir Ihnen zwei Transformationssysteme zur (Solanum Tuberosum) Kartoffelpflanzen gentechnisch zu verändern. A. Tumefaciens Transformation Blätter sind infiziert, die transformierten Zellen ausgewählt sind und eine neue komplette transformierte Pflanze regeneriert mit Phytohormonen in 18 Wochen. In A. Rhizogenes Verwandlung Stiele sind durch die Injektion von Bakterien mit einer Nadel infiziert, die neue entstandenen transformierten behaarte Wurzeln werden mit einem roten fluoreszierenden Marker erkannt und die nicht-transformierten Wurzeln entfernt werden. In ca. 5-6 Wochen ist die resultierende Anlage eines Verbundes aus einem Wildtyp-Shooting mit voll entwickelten transformierten behaarte Wurzeln. Um die Biomasse zu erhöhen, können die transformierten behaarte Wurzeln herausgeschnitten und selbst propagiert werden. Wir angewendet beide Agrobakterium -vermittelten Umwandlung Methoden um Wurzeln mit dem Ausdruck der GUS Reportergens angetrieben von einem Suberin biosynthetischen gen Förderer zu erhalten. Die GUS-Färbeverfahren wird zur Verfügung gestellt und ermöglicht es die Zelle Lokalisierung der Projektträger Induktion. Bei beiden Methoden zeigten die transformierten Kartoffel Wurzeln GUS Färbung im suberized Endodermis und Exodermis, und darüber hinaus in A. Rhizogenes verwandelt Wurzeln der GUS-Aktivität auch bei der Entstehung von Seitenwurzeln erkannt wurde. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass A. Rhizogenes ist ein schnell alternative Werkzeug, um die Gene zu studieren, die in Wurzeln zum Ausdruck kommen.

Agrobacterium rhizogenes -vermittelte Umwandlung der Kartoffel
In diesem Manuskript präsentiert das Schritt für Schritt Verfahren eingerichtet, um transformierte Wurzel mit A. Rhizogenes zu erhalten. Abbildung 1 zeigt eine Übersicht über das Verfahren, das insgesamt rund 5 bis 6 Wochen (von Injektion von A. Rhizogenes dauert , ausgerei...

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Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium Tumefaciens und Agrobacterium Rhizogenes-vermittelte Umwandlung der Kartoffel und die Promotoraktivität eines Suberin-Gens durch GUS Staining

Hier präsentieren wir Ihnen zwei Protokolle, Kartoffelpflanzen zu verwandeln. Die Agrobacterium Tumefaciens Transformation führt zu einer kompletten transgenen Pflanze Agrobacterium Rhizogenes transgenen behaarte Wurzeln in einem Wildtyp-Shooting produziert, die selbst propagiert werden kann. Wir erkennen dann Promotoraktivität von GUS Färbung in den transformierten Wurzeln.

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Die agrobacterium-vermittelte Transformation ist eine einfache Methode zur Herstellung gentechnisch veränderter Kartoffelpflanzen. Um bestimmte Genfunktionen und ihren Beitrag zur Organphysiologie zu verstehen. Die Transformation durch Agrobacterium rhizogenes ist ein robustes Werkzeug zur schnellen Beurteilung der Genfunktionswurzeln, da ähnliche Ergebnisse durch Agrobacterium tumefaciens Transformation erzielt werden können.Demonstriert wird dieses Verfahren von Sandra Fernandez-Pinan, einer Post-Doc, und Jennifer Lopez, einer Studentin von maste5r aus unserem Labor. Beginnen Sie mit dem Anbau einer einzigen Agrobacterium-Kolonie über Nacht in fünf Milliliter Hefe-Extrakt-Brühe, oder YEB-Medium, ergänzt mit Antibiotika in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr bei 28 Grad Celsius, bei 200 Rotationen pro Minute. Für die A-tumefaciens-Transformation, messen Sie die optische Dichte am nächsten Morgen.Wenn die optische Dichte bei 600 Nanometern oder OD 600 0,6 bis eins erreicht, zentrifugieren Sie einen Milliliter der Agrobacterium-Kultur und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter frischem YEB-Medium ohne Antibiotika wieder auf. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in frischem YEB-Medium ohne Antibiotika auf die entsprechende Konzentration aussetzen, um eine endgültige OD 600 von 0,8 zu erhalten, und die Bakterienzellen auf Eis legen. Für die Pflanzentransformation mit A.rhizogenes, übertragen Sie sorgfältig eine Spenderpflanze von einer 2MS-Mittelkultur auf eine 120 mal 120 Millimeter quadratische Platte und verwenden Sie eine chirurgische Nadel, um drei Mikroliter aus einer A.rhyzogenes-Kultur in verschiedene Stamminternodien wie möglich zu injizieren.Dann die gesamte Pflanze sofort auf eine neue quadratische Platte mit festem MS-Medium übertragen, ergänzt durch 0,1 Millimolar Acetosyringon. Nachdem Sie eine zweite Pflanze auf dieselbe Platte platziert haben, die auf die gleiche Weise umgewandelt wurde, versiegeln Sie die Platte mit chirurgischem Klebeband und legen Sie die Platte vier Tage lang vertikal in einen Wachstumsschrank. Übertragen Sie die Pflanze auf eine quadratische Platte mit MS-Medium mit Cefotaxim-Natrium ergänzt, um die A.rhizogenes zu töten und legen Sie die versiegelte Platte vertikal in einem Wachstumsschrank für vier Tage.Nach 10 bis 12 Tagen erscheinen neue haarige Wurzeln. Ihre Transformation kann durch fluoreszierendes Stereomikroskop bestätigt werden. Zu diesem Zeitpunkt verbrauchen Sie die einheimischen Wurzeln jeder Pflanze, und übertragen Sie die Pflanzen auf eine neue quadratische Platte mit MS-Medium, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium, um die A.rhizogenes zu töten.Um eine Verbundpflanze zu erhalten, lassen Sie die transgenen haarigen Wurzeln für weitere drei bis vier Wochen im MS-Medium wachsen, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium. Für die Pflanzentransformation mit A.tumefaciens. Schneiden und legen Sie ein Blatt von einer drei bis vier Wochen alten Pflanze in einer Petrischale, und verwenden Sie ein Skalpell, um ein bis drei Querschnitte von der Mitte des Blattes zu den Rändern zu machen, ohne die Stücke vom Blatt zu schneiden.und die Petiole auszuschließen. Legen Sie das Blatt sofort in eine Petrischale mit 10 Milliliterfrischem 2MS flüssigem Medium, abaxialer Seite nach oben, und bedecken Sie die Platte. 80 Mikroliter der A.tumefaciens-Kultur schnell in das flüssige Medium geben und das Medium eine Minute lang vorsichtig umrühren, um die bakterielle Lösung homogen zu verteilen.Dann die Platte sorgfältig versiegeln und mit Aluminiumfolie bedecken, um eine zweitägige Inkubation in einer 24-Grad-Celsius-Kammer zu erhalten. Am Ende der Transformationsphase die Blätter abaxial-seite nach oben übertragen, auf das kalden-induzierende Medium, mit Einer Pinzette für eine einwöchige Inkubation im Wachstumskabinett abgekratzt. Am Ende der Inkubation die Blätter, abaxial-Seite nach oben, auf eine Tweezerzerzerinduzierendes Medium übertragen und die Blätter in einem Wachstumsschrank bebrüten.Wenn die entstandenen Rutschen etwa zwei Zentimeter hoch sind, schneiden Sie aus jedem Callous drei auftauchende Rutschen. Legen Sie bis zu fünf verschiedene Rutsche Transformation Ereignisse in einzelne Kulturkolben mit MG-Medium mit Cefotaxim-Natrium ergänzt, um Verwurzelung zu ermöglichen, und beschriften Sie die Teilmenge als geeignet für eine drei bis vier Wochen Inkubation im Wachstumsschrank, bis die Rutschen kräftig sind. Wählen Sie am Ende der Inkubation die kräftigste Pflanze jedes Ereignisses aus und schneiden Sie die apikalen Segmente der Rutsche mit drei bis vier Internoden aus jeder Pflanze.Legen Sie die Segmente in einen Kulturkolben mit 2MS Medium, ergänzt mit Cefotaxim-Natrium und wachsen Sie die Pflanzen, bis sie kräftige Rutschen und Wurzeln entwickeln. Um einen Beta-Glucuronidase- oder GUS-Histochemikalien-Reporter-Gentest durchzuführen, fixieren Sie die Wurzeln aus einer zwei- bis dreiwöchigen In-vitro-Pflanzenkultur mit 90% gekühltem Aceton für 20 Minuten auf Eis. Am Ende der Fixierung die Wurzeln zweimal in destilliertem Wasser waschen und die Wurzeln 20 Minuten lang mit frischer GUS-Färbelösung unter Vakuum behandeln.Am Ende der Vakuumbehandlung die Wurzeln bei 37 Grad Celsius für etwa vier Stunden im Dunkeln stellen. Wenn eine blaue Farbe sichtbar ist, waschen Sie die Wurzeln zweimal mit 70% Ethanol und visualisieren Sie die Färbung unter einem hellen Feldmikroskop. Transformierte haarige Wurzeln zeigen einen roten Blütenstand, wenn sie mit grünem Licht beleuchtet werden, während negative Kontrolle untransformierte agrobacterium zeigen keine solche Blütenstand, was die Eignung der DS roten Transformation Marker für die Identifizierung transgene behaarte Wurzeln.Hierbei werden GUS-Färbungen in Wurzeln transgener Pflanzen, die durch A.tumefaciens und transgene behaarte Wurzeln von A.rhizogenes erhalten wurden, gezeigt. Wie beobachtet, zeigen Wurzeln, die mit A, Tumefaciens transformiert und in-vitro angebaut werden, blaue Färbung in der Endodermis, einer Zellschicht zwischen Kortex und Stele. Bei weiter entwickelten Wurzeln ist die blaue Beschriftung in der äußeren Schicht fleckig, entsprechend der Exodermis.Bei transformierten haarigen Wurzeln, die von A.rhizogenes erhalten und in Hydroponik angebaut werden, befindet sich der GUS-Marker speziell innerhalb der Endodermis in der Entstehung von Lateralwurzeln in den verwundeten Bereichen und in der Exodermis. Die mit Agrobacterium rhizogenes erhaltenen transgenen Wurzeln waren nicht nur eine schnelle Methode, sondern trugen auch die DNA aus dem wurzelinduzierenden Plasmid, das einige direkt kontrollierte Prozesse deregulieren kann. Die transgenen haarigen Wurzeln, die mit Agrobacterium-Rhizogenen gewonnen werden, können während des Schießens erhalten werden, können aber alternativ vor Ort sein, bis sie in-vitro für eine massive Transitproduktion vermehrt werden.Die Kartoffelumwandlung ist ein gutes Werkzeug, um die Genfunktion und die Promotoraktivierung zu überprüfen und auch methodische Regeln bei einer Art von hohem agronomischem Interesse zu produzieren. Der genetisch veränderte Organismus sollte nach Gebrauch sicher entsorgt werden, um eine Umweltkontamination zu vermeiden. Außerdem enthält die Gaslösung giftige Zyanidderivate, so dass Sie schutzsicher sind und die Lösung sicher entsorgen.

Research

JoVE Journal

Environment

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Bestimmung mikrobieller extrazelluläre Enzymaktivität in Wasser, Böden und Sedimente mit hohem Durchsatz Mikrotiterplatten-Assays

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Forschung

Umwelt

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimierte negative Färbung: ein Hochdurchsatz-Protokoll für die Prüfung kleiner und asymmetrische Proteinstruktur durch Elektronenmikroskopie

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Transient Gene Expression in Tabak mit Gibson Versammlung und die Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

Design und Bau eines Stadt Abfluss Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Ein Fisch-Fütterung Labor Bioassay die antipredatory Aktivität von Sekundärmetaboliten aus dem Gewebe mariner Organismen beurteilen

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA-Methode 1615 Messung der Enterovirus und Norovirus Vorkommen in Wasser, Kultur und RT-qPCR. Teil III. Virenerkennung durch RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spek Cheetahs: Identifizierung von Personen durch ihre Spuren

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Gleichzeitige DNA-RNA-Extraktion aus Küstensedimenten und Quantifizierung von 16S rRNA-Gene und Transkripte von Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirische, metagenomischen und Computertechniken beleuchten die Mechanismen, durch welche Fungizide Kompromiss Bienengesundheit

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Die Barnacle Balanus Improvisus als Marine Modell - Kultivierung und Genexpression

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...