Name: agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Dette arbeidet ble støttet av Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI tilskudd til PB), Ministerio de Economía y Competitividad og ble tildelt und finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R), og Universitetet i Girona (PhD stipend for SF og grant SING11/1). Forfatterne er Dr. Inge Broer (Institute for arealbruk, Universitetet i Rostock, Rostock, Tyskland) og Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spania) for å gi A. rhizogenes og A. tumefaciens belastningen, henholdsvis, og Dr. Marçal Soler og Dr. Anna Plasencia for hjelp og støtte i å initiere A. rhizogenes transformasjon eksperimenter (Toulouse III Paul Sabatier University-CNRS, Plant Research Laboratory (LRSV), Castanet Tolosan, Frankrike). Forfatterne takker Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) for hennes verdifull hjelp til å gjennomføre laboratoriearbeid og ta vare på planter, og Ferran Fontdecaba og Carla Sánchez som hjalp med noen av eksperimenter mens de gjorde deres avsluttende grad prosjekter.

A. rhizogenes transformasjon protokollen ble tilpasset og endret Horn et al.7 og genotype testet var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens transformasjon protokollen ble tilpasset og endret fra Banerjee et al.22 og genotyper testet var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) og S. tuberosum ssp. andigena. De viktigste trinnene i begge prosedyrer oppsummeres i figur 1 og...

I potet bruker vanligste systemet er å få stabile transgene anlegg transformasjonen av Agrobacterium tumefaciens stammer som krever organogenesen bruker eksogene phyto-hormoner. Selv om Agrobacterium basert protokollene har potensial til å integrere ikke-T-DNA vektor sekvens25, finnes denne metoden fortsatt den enkleste og billigere å transformere potet planter. Siste årene interessen A. rhizogenes-mediert transformasjon har oppmerksomheten til forskere for å la he...

Bortsett fra økonomiske interesser har generering av transgene planter sin egen relevans i forskning å demonstrere den ultimate funksjonen av gener og å bedre forstå Fræna og utvikling. Mest brukte metoden for plante DNA innsettingspunktet er Agrobacterium-mediert transformasjon. Agrobacterium tumefaciens er kjøpedyktig utvikle crown galls i infiserte vev av mange plantearter av sin svulst-inducing (Ti) plasmider. Plasmider inneholder en T-DNA region med et sett av gener som vil bli integrert i anlegget genomet og indusere vev dedifferentiation1,2. Utveksling av disse genene i T-DNA av av transgene har tillatt generasjonen av bestemt plante modifikasjoner unngå fenotypiske effekter3. For å lette transgene kloning i T-DNA, regionen T-DNA har vært forbrukeravgift i en uavhengig plasmider kalt en binær plasmider, mens resten av genene for Ti plasmider (virulens-genene at T-DNA overføring og innsetting mekanismer) har vært plassert i en hjelper plasmider. For bioteknologi planteforskning transformasjon av A. tumefaciens har flere fordeler: det trenger ikke dyre enheter, stand til å generere både stabil og forbigående anlegget transformasjon, og lave antall genet kopier er integrert i det Kromosom4. Men for de fleste planter, men ikke Arabidopsis, krever generasjonen av stabil transformants anlegget gjenfødelse fra én eller noen få celler ved hjelp av eksogene phyto-hormoner, gjør denne prosessen arbeidskrevende og tidkrevende. A. rhizogenes er også endre anlegget genomet, produsere hårete røtter eller adventivskudd røtter på infeksjon steder på grunn av uttrykket av rol (roten loci) gener kodet i rot-inducing (Ri) plasmider5. Selv om mindre studert enn A. tumefaciens, er A. rhizogenes også brukt for å få transgene røtter. I dette tilfellet inneholder A. rhizogenes den opprinnelige T-DNA i Ri plasmider og en binær plasmider med en andre T-DNA bærer av transgene. Når webområdet infeksjon er i stammer eller hypocotyls, kan en sammensatt plante oppnås, med ny hårete transgene røtter fremvoksende fra vill type skudd. Alternativt, hårete transformert røtter kan vokse selvstendig i vitro i media med karbon kilde innganger. Bruk av A. rhizogenes i stedet for A. tumefaciens å produsere transgene vev er å få relevans når roten er målet orgel, fordi anlegget gjenfødelse er ikke nødvendig og derfor er det raskere og mindre kostnadskrevende. Tidligere studier har vist denne metodikken bevilget for fenotypiske karakterisering av rot, bestemte gener,6,,7,,8,,9.
Potet (Solanum tuberosum) er den fjerde viktigste avlingen i verden ifølge Food and Agriculture Organization av FN (FAO) siden tuber har ernæringsmessige relevans for menneskelig konsum for å være en god kilde til vitaminer og mineraler. Derfor potet er plassert i søkelyset for landbruksprodukter bioteknologi og også regnes som en god biologiske modell for genetiske og utviklingsmessige studier10,11. Potet transformasjon bidratt betydelig til forståelsen av molekylære mekanismer underliggende suberized vev gjennom karakterisering av gener involvert i suberin og voks biosyntesen12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 og transkripsjon regulering19. Suberin feruloyl transferase genet, FHT, er en av disse preget biosyntetiske genene; downregulation gir opphav til en sterk svekkelse av periderm beskyttelse, som er forbundet med en kraftig nedgang i ferulate estere av suberin og voks i potet knoller14. Samtidig, i røtter og frø av Arabidopsis vist fortrengingen i sin antatte orthologue (ASFT/RWP1) også sin rolle i å produsere alkyl ferulates i suberin20,21. I potet viste FHT transcriptional reporter linjen og FHT antistoffer henholdsvis at arrangøren aktiviteten og protein er plassert i exodermis, endodermis, phellogen-derivater og såret vev15.
I dette arbeidet detalj vi en protokoll bruke A. rhizogenes å produsere transgene hårete røtter som vedlikeholdes i en vill type skyte, genererer sammensatt potet planter eller forbrukeravgift for å vokse selvstendig i vitro. Vi tilbyr også protokollen bruker A. tumefaciens for å få komplett transgene potet planter. Som en casestudie brukes A. rhizogenes og A. tumefaciens forvandlet med samme binære vektoren til å få røtter med FHT arrangøren kjøring GUS reporter genuttrykk. Resultatene rapporteres og forhold.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="559">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1.310.071.21
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetosyringone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Acros
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			115540050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Aquarium pump
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Prodac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			MP350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Autoclave
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Ragpa Strelimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Bacteriological agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1800
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			BAP
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			B0904
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:20px;">
			Beef extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:20px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:20px;">
			1700
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant growing cabinet
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Nuaire
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Carbenicillin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0109
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Cefotaxime sodium
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0111
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			DMSO
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1029310161
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ecotron infors
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			HT
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			29378
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1,009,831,011
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Falcon tube
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Control tecnica
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			CFT011500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferricyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			101001081
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferrocyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			100979088
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Apiglass
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			ref16
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			GA3
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G7645
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gamborg B5 media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G0210
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gelrite
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G1101
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Glucosa
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G5767
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Kanamycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			K1377
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Leukopor tape
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			BSN Leukopor
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			BDF47467
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Lupe
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Wild-Heerbrugg
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M420
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Magnetic shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Agimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			7000243
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MES hydrate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M2933-25G
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MgSO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131404
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Microscope
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Minufugue centrifugue 5415R
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Murashige and Skoog media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M0254.0050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Na2HPO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131679
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NAA
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			N0903
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaCl
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131659
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaH2PO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			58282
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NightSea Stereo
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			SFA Moonting Adapter
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Parafilm
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			PRFL-001-001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Peptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1616
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Petri dishes (90 x 14)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			pHmetre
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Crison
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Phytotron
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Inkoa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			RFTI-R5485
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant Agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			P1001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Refrigeratot
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Liebherr Medline
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Rifampicin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			R0146
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectinomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			59007
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectrophotometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Shimadzu
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Square plates (120 x 120)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Deltalab
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			S6501
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:22px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:161px;height:22px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:22px;">
			131621
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical blades
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Swann-Morton
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			201
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical needle
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			NIPRO
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			015/0204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1612
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triton
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Serva
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			37240
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Unimax 1010 shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Heidolph
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Vacuum
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Dinko
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Biosynth
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			B-7398
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Yeast extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1702.00
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Zeatin riboside
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1001042850
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining

Agrobacterium sp. er en av de mest brukte metodene for å få transgene planter som har evnen til å overføre og integrere sine egne T-DNA i anlegget genom. Her presenterer vi to transformasjon systemer for å endre genetisk potet (Solanum tuberosum) planter. I A. tumefaciens transformasjon, bladene er infisert, forvandlet cellene er valgt og en ny fullstendig forvandlet anlegg genereres med phyto-hormoner i 18 uker. I A. rhizogenes transformasjon stammer er infisert av sprøytebruk bakterier med en nål, nye fremkom transformert hårete røttene registreres med en rød fluorescerende markør og ikke-transformert røttene er fjernet. I 5-6 uker er resulterende anlegget sammensatt av en vill type skyte med fullt utviklet transformert hårete røtter. For å øke biomasse, kan transformert hårete røttene forbrukeravgift og selv overført. Vi brukt både Agrobacterium -mediert transformasjon metoder for å få røtter uttrykke GUS reporter genet drevet av en suberin biosyntetiske genet promoter. GUS flekker prosedyren er gitt og lar den celle lokaliseringen av arrangøren induksjon. I både metoder viste transformert potet røttene GUS flekker i suberized endodermis og exodermis, og i tillegg A. rhizogenes forvandlet røtter GUS aktiviteten ble også oppdaget i fremveksten av lateral røtter. Disse resultatene tyder på at A. rhizogenes kan være en rask verktøy å studere gener som er uttrykt i røtter.

Agrobacterium rhizogenes -mediert potet transformasjon
I dette manuskriptet presenteres fremgangsmåte som er konfigurert til å hente transformert rot med A. rhizogenes . Figur 1 viser en oversikt over prosedyren, som tar helt rundt 5-6 uker (fra injeksjon av A. rhizogenes å oppnå fullt utviklet hårete røtter). Deretter kan anlegget s...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens og Agrobacterium rhizogenes-mediert transformasjon av potet og Promoter aktiviteten med et Suberin av GUS Staining

Her presenterer vi to protokoller for å transformere potet planter. Agrobacterium tumefaciens transformasjonen fører til en komplett transgene plante mens Agrobacterium rhizogenes produserer transgene hårete røtter i vill type skyte kan selv overført. Vi oppdager promoter aktivitet av GUS flekker i transformert røttene.

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Den agrobacterium-medierte transformasjonen er en enkel metode for å produsere genmodifiserte potetplanter. For å forstå spesifikke genfunksjoner og deres bidrag til organfysiologi. Transformasjon av agrobacterium rhizogenes er et robust verktøy for raskt å vurdere genfunksjonelle røtter, da lignende resultater kan oppnås ved agrobacterium tumefaciens transformasjon.Viser denne prosedyren vil være Sandra Fernandez-Pinan, en post-doc, og Jennifer Lopez, en maste5r student fra vår lab. Begynn med å dyrke en enkelt agrobacterium koloni over natten i fem milliliter gjær ekstrakt kjøttkraft, eller YEB medium, supplert med antibiotika i en 50 milliliter sentrifuge rør på 28 grader Celsius, på 200 rotasjoner per minutt. For a-tumefaciens transformasjon, måle den optiske tettheten neste morgen.Når den optiske tettheten på 600 nanometer, eller OD 600 når 0,6 til en, sentrifuge en milliliter av agrobacterium kultur og gjenbruke pellet i en milliliter frisk YEB medium uten antibiotika. Etter den andre vasken, resuspend pellet i frisk YEB medium uten antibiotika, til riktig konsentrasjon for å oppnå en endelig OD 600 av 0,8, og plasser bakteriecellene på is. For plantetransformasjon ved hjelp av A.rhizogenes, nøye overføre en donor plante fra en 2MS medium kultur til en 120 av 120 millimeter firkantet plate, og bruke en kirurgisk nål til å injisere tre mikroliter fra en A.rhyzogenes kultur til ulike stammen internodes som mulig.Deretter umiddelbart overføre hele anlegget til en ny firkantet plate som inneholder solid MS medium, supplert med 0,1 millimolar acetosyringone. Etter å ha plassert en annen plante på samme plate, forvandlet på samme måte, forsegle platen med kirurgisk tape, og plasser platen vertikalt inne i et vekstskap i fire dager. Overfør planten til en firkantet plate med MS medium supplert med cefotaxime natrium for å drepe A.rhizogenes og plassere den forseglede platen vertikalt inne i et vekstskap i fire dager.Etter 10 til 12 dager vil nye hårete røtter vises. Deres transformasjon kan bekreftes av fluorescerende stereomikroskop. På denne tiden, avgiftsdirektoratet de innfødte røttene til hver plante, og overføre plantene til en ny firkantet plate med MS medium, supplert med cefotaxime natrium for å drepe A.rhizogenes.For å få en sammensatt plante, la transgene hårete røtter vokse i ytterligere tre til fire uker i MS medium, supplert med cefotaxime natrium. For plantetransformasjon ved hjelp av A.tumefaciens. Klipp og legg et blad fra en tre til fire uker gammel plante i en petriskål, og bruk en skalpell for å lage en til tre tverrgående kutt fra midten av bladet til kantene uten å kutte bitene av bladet.og for å utelukke petiole. Legg umiddelbart bladet i en petriskål som inneholder 10 milliliter friskt 2MS flytende medium, abaxial side opp, og dekk platen. Tilsett raskt 80 mikroliter av A.tumefaciens-kulturen til væskemediet og rør forsiktig mediet i ett minutt for å homogent distribuere bakterieoppløsningen.Deretter forsegler og dekker platen forsiktig med aluminiumsfolie for en to-dagers inkubasjon i et 24-graders Celsius-kammer. På slutten av transformasjonsperioden overfører du bladene abaxial-side opp, til det ufølsomme-induserende mediet, skrapt med pinsett for en ukes inkubasjon i vekstskapet. På slutten av inkubasjonen, overføre bladene, abaxial-side opp, på pinsett-skrapt skyte inducing medium, og inkubere bladene i et vekstskap.Når de fremvoksende chutes er omtrent to centimeter høye, kutt tre nye chutes fra hver ufølsom. Plasser opptil fem forskjellige chute transformasjon hendelser i individuelle kultur kolbe som inneholder MG medium supplert med cefotaxime natrium for å tillate rooting, og merke undergruppen som passer for en tre til fire ukers inkubasjon i vekstskapet til chutes er kraftig. På slutten av inkubasjonen velger du den kraftigste planten av hver hendelse, og kutter de a apiske segmentene av sjakten med tre til fire internoder fra hver plante.Plasser segmentene i en kulturkolbe som inneholder 2MS medium supplert med cefotaksimenatrium og dyrke plantene til de utvikler kraftige chutes og røtter. For å utføre en beta-glukuroniidase eller GUS histokjemisk reporter genanalyse, fikse røttene fra en to til tre ukers in-vitro plantekultur med 90% kjølt aceton i 20 minutter på is. På slutten av fikseringen vasker du røttene to ganger i destillert vann og behandler røttene med fersk GUS-fargingsløsning under vakuum i 20 minutter.På slutten av vakuumbehandlingen, plasser røttene ved 37 grader Celsius i mørket i omtrent fire timer. Når en blå farge er synlig, vask røttene to ganger med 70% etanol, og visualiser fargingen under et lyst feltmikroskop. Forvandlede hårete røtter viser en rød florescence når de belyses med grønt lys, mens negativ kontroll uoverført agrobacterium ikke viser noen slik florescence, noe som indikerer egnetheten til DS rød transformasjonsmarkør for å identifisere transgene hårete røtter.Her vises GUS-farging i røtter av transgene planter oppnådd av A.tumefaciens og transgene hårete røtter oppnådd av A.rhizogenes. Som observert, røtter forvandlet med A, tumefaciens og vokst in-vitro, demonstrere blå flekker i endodermis, et cellelag mellom cortex og stele. I mer utviklede røtter er den blå merkingen ujevn i det ytre laget, tilsvarende exodermis.I forvandlet hårete røtter oppnådd av A.rhizogenes, og dyrket i hydroponics, gus markør er spesielt plassert innenfor endodermis i fremveksten av laterale røtter i de sårede områdene og i exodermis. I tillegg til å være en rask metode, de transgene røttene oppnådd med agrobacterium rhizogenes bar også DNA fra rotfremkallende plasmid, som kan deregulere noen direkte kontrollerte prosesser. De transgene hårete røttene oppnådd med agrobacterium rhizogenes kan opprettholdes mens de skyter, men alternativt kan være på stedet til spredt in-vitro for massiv transittproduksjon.Potettransformasjonen gir et godt verktøy for å sjekke genfunksjonen og promotoraktivering, og også å produsere metodiske regler i en art av høy agronomisk interesse. Den genmodifiserte organismen skal kastes trygt etter bruk for å unngå miljøforurensning. Gassoppløsning inneholder også giftig cyanidderivat, så bruk beskyttelse og kast oppløsningen på en sikker måte.

Research

JoVE Journal

Environment

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Fastsettelse av Microbial Ekstracellulær enzymaktivitet i Waters, jord og sedimenter ved hjelp av høy gjennomstrømming for mikro Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimalisert negativ farging: en High-throughput Protokoll for Undersøke Liten og Asymmetric Protein struktur ved elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Forbigående Gene Expression i Tobacco bruker Gibson forsamling og Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

Design og bygging av en Urban Avrenning Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

A Fish-fôring Laboratory Bioassay å Vurdere Antipredatory aktivitet av sekundære metabolitter fra vev av marine organismer

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615. Måling av Enterovirus og Norovirus Forekomst i Water av Kultur- og RT-qPCR. Del III. Virus Detection ved RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Dynamo Kiev: Identifisere enkeltpersoner med sine Footprints

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Samtidig DNA-RNA Utvinning fra Kyst Sedimenter og kvantifisering av 16S rRNA gener og transkripsjoner av Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirisk, Metagenomic og beregningsorientert teknikker belyse mekanismer av hvilke soppmidler kompromiss Bee helse

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Barnacle Balanus improvisus som Marine modell - dyrking og genuttrykk

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...