Name: agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant para PB), o Ministerio de Economía y competitividade e FEDER financiamento (36725-AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) e a Universidade de Girona (bolsa de doutorado para SF e grant SING11/1). Os autores são gratos ao Dr. Inge Broer (Instituto para o uso da terra, Universidade de Rostock, Rostock, Alemanha) e Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Espanha) para fornecer o a. rhizogenes e a cepa da . tumefaciens , respectivamente e Dr. Marçal Soler e Dr. Anna Plasencia para a ajuda e o apoio recebido no início das experiências de transformação a. rhizogenes (Toulouse III Paul Sabatier University — CNRS, laboratório de pesquisa da planta (LRSV), Castanet Tolosan, A França). Os autores agradecer sua valiosa assistência na realização do trabalho de laboratório e cuidar de plantas e Ferran Fontdecaba e Carla Sánchez assistida com alguns dos experimentos enquanto eles estavam fazendo Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) seus projetos de grau final.

O protocolo de transformação a. rhizogenes foi adaptado e modificado de Horn et al.7 e o genótipo testado foi S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). O protocolo de transformação da . tumefaciens foi adaptado e modificado de Banerjee et al.22 e os genótipos testados foram S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena. As principais etapas de ambos os procedimentos sã...

Em batata, o sistema mais comum para obter plantas transgênicas completas estáveis usa a transformação por cepas de Agrobacterium tumefaciens que exigem organogênese usando fitohormônios exógenos. Embora os protocolos de Agrobacterium baseado tem potencial para integrar o vetor não-T-DNA sequência25, esta metodologia é ainda o mais fácil e menos caro disponível para transformar plantas de batata. Durante os últimos anos, o interesse na . rhizogenes-transform...

Além de interesse econômico, a geração de plantas transgênicas tem sua própria relevância na pesquisa para demonstrar a função final dos genes e para entender melhor a fisiologia vegetal e desenvolvimento. O mais amplamente utilizado método para inserção de DNA de plantas é Agrobacterium-mediado transformação. Agrobacterium tumefaciens é capaz de gerar coroa galhas em muitas espécies de plantas, o tecido infectado pela ação do seu do plasmídeo indutor de tumor (Ti). O plasmídeo contém uma região de T-DNA com um conjunto de genes que será integrado no genoma da planta e induzir o tecido quê1,2. A troca destes genes dentro do T-DNA pelo transgene permitiu a geração de modificações específicas planta evitando efeitos fenotípicos3. Para facilitar o transgene clonagem no T-ADN, a região de T-DNA tem sido retirada em um plasmídeo independente chamado um plasmídeo de binário, enquanto o resto dos genes do plasmídeo Ti (os genes de virulência que permitem que os mecanismos de transferência e inserção de T-DNA) têm sido colocadas em um plasmídeo ajudante. Para pesquisa de biotecnologia de plantas, transformação pela . tumefaciens tem várias vantagens: não necessita de dispositivos caros, é capaz de gerar tanto transformação planta estável e transitória e baixo número de cópias são integradas de gene a cromossoma4. No entanto, para a maioria das plantas, mas não de Arabidopsis, a geração de transformants estável requer regeneração de plantas de uma única ou algumas células usando fitohormônios exógenos, tornando este processo trabalhoso e demorado. A. rhizogenes também é capaz de modificar o genoma da planta, produzindo raízes peludas ou adventícias raízes dos locais de infecção devido a expressão de genes de rol (raiz loci) codificado na raiz de indução (Ri) do plasmídeo5. Embora menos estudado do que a. tumefaciens, a. rhizogenes também é usado para a obtenção de raízes transgénicas. Neste caso, a a. rhizogenes contém o T-DNA original no plasmídeo Ri e um plasmídeo binário com um segundo T-DNA carregando o transgene. Quando o local de infecção é em hastes ou hipocótilo, uma planta composta pode ser obtida, com novas raízes transgénicas peludas emergentes de rebentos de tipo selvagem. Alternativamente, raízes transformadas peludas podem crescer autonomamente em vitro na mídia com entradas de fonte de carbono. O uso de a. rhizogenes em vez de a. tumefaciens para produzir tecidos transgênicos está ganhando relevância quando a raiz é o órgão-alvo, porque a regeneração da planta não é necessária e, portanto, é mais rápido e menos dispendioso. Estudos anteriores têm demonstrado esta metodologia apropriada para a caracterização fenotípica de raiz genes específicos6,7,8,9.
A batata (Solanum tuberosum) é a quarta mais importante colheita no mundo de acordo com a organização a alimentação e agricultura das Nações Unidas (FAO) desde que o tubérculo tem relevância nutricional para consumo humano, por ser uma boa fonte de vitaminas e minerais. Por esse motivo, a batata foi colocada no centro do atenções da biotecnologia agrícola e também é considerada como um bom modelo biológico para genética e do desenvolvimento de estudos de10,11. Transformação de batata contribuiu significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes tecidos cor através da caracterização de genes envolveram em suberina e cera biossíntese12,13,14 ,15,16,17, suberina monômero transporte18 e transcrição Regulamento19. Gene da suberina feruloyl transferase, FHT, é um destes genes biossintéticos caracterizadas; seu downregulation dá origem a um forte comprometimento da proteção periderme, que está correlacionado com uma forte diminuição em ésteres Ferulato de suberina e ceras em tubérculos de batata14. Concomitantemente, nas raízes e sementes de Arabidopsis, o nocaute do seu putativo orthologue (ASFT/RWP1), também demonstrou seu papel na produção de ferulates de alquila em suberina20,21. Na batata, a linha de repórter transcriptional FHT e o anticorpo FHT mostraram respectivamente que a atividade de promotor e a proteína estão localizados na exoderme, a endoderme, os felogênio-derivados e em tecidos feridos,15.
Neste trabalho, detalhamos um protocolo utilizando a. rhizogenes para produzir transgênicas raízes peludas que são mantidas em uma sessão do tipo selvagem, gerando plantas de batata composto ou extirpado para crescer autonomamente em vitro. Nós também fornecemos o protocolo utilizando a. tumefaciens para obter plantas de batata transgénica completa. Como um estudo de caso, a. rhizogenes e a. tumefaciens transformada com o vetor binário mesmo são usados para obter as raízes com o promotor FHT dirigindo a expressão do gene repórter GUS . Os resultados são relatados e comparados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="559">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1.310.071.21
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetosyringone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Acros
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			115540050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Aquarium pump
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Prodac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			MP350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Autoclave
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Ragpa Strelimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Bacteriological agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1800
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			BAP
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			B0904
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:20px;">
			Beef extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:20px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:20px;">
			1700
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant growing cabinet
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Nuaire
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Carbenicillin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0109
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Cefotaxime sodium
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0111
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			DMSO
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1029310161
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ecotron infors
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			HT
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			29378
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1,009,831,011
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Falcon tube
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Control tecnica
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			CFT011500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferricyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			101001081
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferrocyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			100979088
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Apiglass
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			ref16
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			GA3
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G7645
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gamborg B5 media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G0210
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gelrite
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G1101
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Glucosa
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G5767
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Kanamycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			K1377
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Leukopor tape
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			BSN Leukopor
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			BDF47467
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Lupe
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Wild-Heerbrugg
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M420
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Magnetic shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Agimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			7000243
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MES hydrate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M2933-25G
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MgSO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131404
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Microscope
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Minufugue centrifugue 5415R
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Murashige and Skoog media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M0254.0050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Na2HPO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131679
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NAA
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			N0903
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaCl
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131659
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaH2PO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			58282
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NightSea Stereo
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			SFA Moonting Adapter
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Parafilm
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			PRFL-001-001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Peptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1616
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Petri dishes (90 x 14)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			pHmetre
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Crison
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Phytotron
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Inkoa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			RFTI-R5485
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant Agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			P1001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Refrigeratot
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Liebherr Medline
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Rifampicin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			R0146
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectinomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			59007
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectrophotometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Shimadzu
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Square plates (120 x 120)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Deltalab
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			S6501
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:22px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:161px;height:22px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:22px;">
			131621
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical blades
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Swann-Morton
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			201
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical needle
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			NIPRO
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			015/0204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1612
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triton
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Serva
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			37240
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Unimax 1010 shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Heidolph
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Vacuum
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Dinko
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Biosynth
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			B-7398
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Yeast extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1702.00
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Zeatin riboside
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1001042850
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining

Agrobacterium SP. é um dos métodos mais utilizados para obter plantas transgênicas, pois tem a capacidade de transferir e integrar sua próprias T-DNA no genoma da planta. Aqui, apresentamos dois sistemas de transformação para modificar geneticamente as plantas de batata (Solanum tuberosum). Na transformação da . tumefaciens , folhas são infectadas, as células transformadas são Selecionadodas e uma nova planta completa de transformada é regenerada usando fitohormônios em 18 semanas. Na transformação da . rhizogenes , hastes estão infectados por injetar a bactéria com uma agulha, as novas raízes peludas surgiu transformadas são detectadas usando um marcador fluorescente vermelho e as raízes não-transformadas são removidas. Em 5-6 semanas, a planta resultante é um composto de um tiro de tipo selvagem com raízes peludas transformados totalmente desenvolvidos. Para aumentar a biomassa, as raízes peludas transformadas podem ser extirpadas e self propagadas. Nós aplicamos os dois métodos de transformação Agrobacterium -mediada para obter raízes expressando o gene repórter GUS impulsionado por um promotor do gene biossintética de suberina. O procedimento de coloração GUS é fornecido e permite a localização de célula da indução promotor. Em ambos os métodos, as raízes de batata transformada mostraram GUS coloração na cor endoderme e exoderme e além disso, em raízes de a. rhizogenes transformou a atividade de GUS também foi detectado o surgimento de raízes laterais. Estes resultados sugerem que a. rhizogenes pode ser uma ferramenta rápida alternativa para estudar os genes que são expressos em raízes.

Agrobacterium rhizogenes -mediado transformação de batata
Neste manuscrito, é apresentado o procedimento passo a passo para obter a raiz transformada com a. rhizogenes . A Figura 1 apresenta uma visão geral do processo, que ao todo leva cerca de 5-6 semanas (a partir de injeção da . rhizogenes para obtenção de raízes peludas total...

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

A transformação mediada por agrobacterium é um método fácil para produzir plantas de batata geneticamente modificadas. A fim de entender as funções genéticas específicas e sua contribuição para a fisiologia dos órgãos. A transformação por agrobacterium rhizogenes é uma ferramenta robusta para avaliar rapidamente as raízes do funcionamento genético, pois resultados semelhantes podem ser obtidos pela transformação de tumefaciens de agrobacterium.Demonstrando este procedimento estarão Sandra Fernandez-Pinan, uma pós-doutora, e Jennifer Lopez, uma aluna do Maste5r do nosso laboratório. Comece cultivando uma única colônia de agrobacterium durante a noite em cinco mililitros de caldo extrato de levedura, ou meio YEB, complementado com antibióticos em um tubo de centrífuga de 50 mililitros a 28 graus Celsius, a 200 rotações por minuto. Para uma transformação de tumefaciens, meça a densidade óptica na manhã seguinte.Quando a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD 600 atinge 0,6 a um, centrífugas um mililitro da cultura agrobacterium e resuspensam a pelota em um mililitro de meio YEB fresco sem antibióticos. Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em meio YEB fresco sem antibióticos, para a concentração apropriada para obter um OD final 600 de 0,8, e colocar as células bacterianas no gelo. Para a transformação da planta usando A.rizogenes, transfira cuidadosamente uma planta doador de uma cultura média de 2MS para uma placa quadrada de 120 por 120 milímetros, e use uma agulha cirúrgica para injetar três microlitrais de uma cultura A.rhyzogenes para diferentes troncos internos possível.Em seguida, transfira imediatamente toda a planta para uma nova placa quadrada contendo meio MS sólido, suplementada com acetossiingona de 0,1 milimolar. Depois de colocar uma segunda planta na mesma placa, transformada da mesma maneira, selar a placa com fita cirúrgica, e colocar a placa verticalmente dentro de um armário de crescimento por quatro dias. Transfira a planta para uma placa quadrada com o meio MS complementado com cefotaxime sódio para matar os A.rizogenes e coloque a placa selada verticalmente dentro de um armário de crescimento por quatro dias.Depois de 10 a 12 dias, novas raízes peluda aparecerão. Sua transformação pode ser confirmada por microscópio estéreo fluorescente. Neste momento, extirpa as raízes nativas de cada planta, e transfira as plantas para uma nova placa quadrada com meio MS, suplementada com sódio cefotaxime para matar os A.rizogenes.Para obter uma planta composta, deixe as raízes peludas transgênicas crescerem por mais três a quatro semanas no meio ms, suplementada com sódio cefotaxime. Para transformação de plantas usando A.tumefaciens. Corte e coloque uma folha de uma planta de três a quatro semanas de idade em uma placa de petri, e use um bisturi para fazer um a três cortes transversais do centro da folha até as bordas sem cortar os pedaços da folha.e excluir a petiole. Coloque imediatamente a folha em uma placa de petri contendo 10 mililitros de meio líquido fresco de 2MS, lado abaxial para cima e cubra a placa. Adicione rapidamente 80 microlitadores da cultura A.tumefaciens ao meio líquido e mexa suavemente o meio por um minuto para distribuir homogeneamente a solução bacteriana.Em seguida, sele cuidadosamente e cubra a placa com papel alumínio para uma incubação de dois dias em uma câmara Celsius de 24 graus. Ao final do período de transformação, transfira as folhas para cima, para o meio indutor indutor insensível, raspado com pinças para uma incubação de uma semana no armário de crescimento. No final da incubação, transfira as folhas, abaxial-side para cima, para o tiro raspado de pinça induzindo o meio, e incubar as folhas em um armário de crescimento.Quando os paraquedas emergiu têm cerca de dois centímetros de altura, corte três paraquedas emergentes de cada insensível. Coloque até cinco eventos diferentes de transformação de paraquedas em frascos de cultura individual contendo meio MG complementado com sódio cefotaxime para permitir a raiz, e rotule o subconjunto conforme apropriado para uma incubação de três a quatro semanas no armário de crescimento até que as calhas sejam vigorosas. Ao final da incubação, selecione a planta mais vigorosa de cada evento, e corte os segmentos apical da calha com três a quatro internos de cada planta.Coloque os segmentos em um frasco de cultura contendo meio 2MS suplementado com sódio cefotaxime e plante as plantas até que desenvolvam calhas e raízes vigorosas. Para realizar um ensaio genético de repórter histoquímico beta-glucuronidase ou GUS histoquímico, fixar as raízes de uma cultura de plantas in vitro de duas a três semanas com acetona 90% refrigerada por 20 minutos no gelo. No final da fixação, lave as raízes duas vezes em água destilada e trate as raízes com uma solução fresca de coloração GUS sob vácuo por 20 minutos.No final do tratamento a vácuo, coloque as raízes a 37 graus Celsius no escuro por cerca de quatro horas. Quando uma cor azul é visível, lave as raízes duas vezes com 70% de etanol, e visualize a mancha sob um microscópio de campo brilhante. Raízes peludas transformadas exibem uma florescência vermelha quando iluminadas com luz verde, enquanto o controle negativo agrobacterium não transformado não demonstra tal florescência, indicando a adequação do marcador de transformação vermelha DS para identificar raízes peludas transgênicas.Aqui, as manchas gus em raízes de plantas transgênicas obtidas por A.tumefaciens e raízes peludas transgênicas obtidas por A.rizogenes são mostradas. Como observado, raízes transformadas com A, tumefaciens e cultivadas in vitro, demonstram manchas azuis na endoderme, uma camada celular entre o córtex e a estela. Em raízes mais desenvolvidas, a rotulagem azul é irregular na camada externa, correspondente à exoderme.Em raízes peludas transformadas obtidas por A.rizogenes, e cultivadas em hidroponia, o marcador GUS está especificamente localizado dentro da endoderme no surgimento de raízes laterais nas áreas feridas e nas exodermeis. Além de ser um método rápido, as raízes transgênicas obtidas com rizogenes agrobacterium também carregavam o DNA do plasmídeo indutor de raízes, que pode desregulamentar alguns processos diretamente controlados. As raízes peludas transgênicas obtidas com rizogenes agrobacterium podem ser mantidas durante a filmagem, mas alternativamente podem estar no local até propagar in vitro para produção massiva de trânsito.A transformação da batata fornece uma boa ferramenta para verificar a função genética e a ativação do promotor, e também para produzir regras metodológicas em uma espécie de alto interesse agronômico. O organismo geneticamente modificado deve ser descartado com segurança após o uso para evitar contaminação ambiental. Além disso, a solução de gás contém derivados tóxicos de cianeto, por isso use proteção e descarte a solução com segurança.

Research

JoVE Journal

Environment

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Determinação da Microbial Extracelular Enzyme actividade nas águas, solos e sedimentos, utilizando alta taxa de transferência de microplaca Ensaios

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Ambiente

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimizado coloração negativa: um protocolo de alta capacidade para Examinando pequeno e assimétrico Estrutura de proteínas por microscopia eletrônica

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Expressão Gênica transiente em tabaco usando Assembleia Gibson eo Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

Projeto e Construção de um Mecanismo de Pesquisa escoamento urbano

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

A Laboratory Bioassay alimentando-Fish para avaliar a actividade anti-predação de metabolitos secundários a partir de tecidos de organismos marinhos

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Método 1615. Medição de Enterovirus e Norovirus Ocorrência na água por cultura e RT-qPCR. Parte III. Detecção de vírus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: Indivíduos Identificação por suas pegadas

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

DNA-RNA simultânea de extração de sedimentos costeiros e quantificação de 16S rRNA genes e transcritos por PCR em tempo real

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Técnicas empíricas, metagenômicas e computacionais iluminam os mecanismos pelos quais os fungicidas comprometem a saúde das abelhas

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...