Name: agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining
Uploaded: 2019-03-29T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Detta arbete stöddes av Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant till PB), Ministerio de Economía y Competitividad och FEDER finansiering (AGL2012-36725, AGL2015-67495-C2-1-R) och den universitet Girona (PhD stipendium till SF och grant SING11/1). Författarna är tacksamma till Dr Inge Broer (Institutet för markanvändning, universitetar av Rostock, Rostock, Tyskland) och Dr Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Spanien) för att tillhandahålla den A. rhizogenes och A. tumefaciens stam, respektive, och Dr Marçal Soler och Dr Anna Plasencia för hjälp och stöd som fick inleda A. rhizogenes transformation experimenten (Toulouse III Paul Sabatier universitet — CNRS, växt forskning laboratorium (LRSV), Castanet Tolosan, Frankrike). Författarna tackar Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) för hennes värdefulla bistånd vid genomförande av laboratoriearbetet och skötsel av växter, och Ferran Fontdecaba och Carla Sánchez som bistod med några av experiment medan de gjorde deras slutliga examensarbeten.

A. rhizogenes transformation protokollet var anpassas och ändras från Horn et al.7 och den genotyp som testade var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée). A. tumefaciens omvandling protokollet var anpassas och ändras från Banerjee et al.22 och de genotyper som testade var S. tuberosum ssp. tuberosum (cv. Désirée) och S. tuberosum ssp. andigena. De viktigaste stegen i båda förfarandena samma...

I potatis använder det vanligaste systemet att få stabil komplett transgena växter omvandlingen av Agrobacterium tumefaciens stammar som kräver organogenesen använder exogent fytohormoner. Även om de Agrobacterium baserat protokoll har potential att integrera icke-T-DNA vektor sekvens25, finns denna metod fortfarande det enklaste och billigare att omvandla potatisplantor. Under senaste åren har intresset för A. rhizogenes-medierad omvandling har fått uppmärksam...

Bortsett från ekonomiska intresse har generering av transgena växter sin egen betydelse i forskning att demonstrera den ultimata funktionen av gener och att bättre förstå växtfysiologi och utveckling. Mest använda metoden för växt DNA införande är Agrobacterium-medierad omvandling. Agrobacterium tumefaciens är kunna generera crown galls i vävnaden som har infekterats av många växtarter av dess tumör-inducerande (Ti) plasmid. Plasmiden innehåller en T-DNA region med en uppsättning gener som kommer att integreras i växten genomet och inducera vävnad dedifferentiering1,2. Utbyte av dessa gener inom T-DNA av transgenens har tillåtit generationen av särskilda växt ändringar att undvika fenotypisk effekter3. För att underlätta den transgenens kloning i T-DNA, regionen T-DNA har varit censurerade i en oberoende plasmid som kallas ett binärt plasmid, medan resten av generna av Ti plasmiden (de virulensgener som gör T-DNA överföring och insättning mekanismerna) har varit placeras i en helper plasmid. För bioteknik växtforskning omvandling av A. tumefaciens har flera fördelar: det behöver inte dyra enheter, kan generera både stabil och övergående växt förvandling och lågt antal gene kopior är integrerade i den kromosom4. Men för de flesta växter, men inte, Arabidopsis kräver generering av stabila transformants anläggningen förnyelse från en enda eller ett fåtal celler använder exogent fytohormoner, att göra denna process mödosam och tidskrävande. A. rhizogenes är också kunna ändra växt genomet, producerar håriga rötter eller oavsiktlig rötter på infektion platser på grund av uttrycket av rol (roten loci) gener kodade i rot-inducerande (Ri) plasmid5. Även om mindre studerade än A. tumefaciens, används A. rhizogenes också för att erhålla transgena rötter. I det här fallet innehåller den A. rhizogenes den ursprungliga T-DNA i Ri plasmiden och ett binärt plasmid med en andra T-DNA bär transgenens. När webbplatsen infektion är i stjälkar eller hypocotyls, kan en komposit växt erhållas, med nya hårig transgena rötter framväxande från vildtyp skott. Alternativt kan hårig transformerad rötter växa självständigt i vitro i media med kol källa ingångar. Användning av A. rhizogenes istället för A. tumefaciens att producera transgena vävnad vinner relevans när roten är målorganet, eftersom växten förnyelse krävs inte och därför är det snabbare och mindre kostsamma. Tidigare studier har visat denna metod som disponeras för fenotypisk karakterisering av roten specifika gener6,7,8,9.
Potatis (Solanumtuberosum) är den fjärde viktigaste grödan i världen enligt livsmedels- och jordbruksorganisation av FN (FAO) eftersom knölen har näringsmässiga betydelse livsmedel för att vara en bra källa av vitaminer och mineraler. Därför potatis har placerats i strålkastarljuset i jordbruket bioteknik och också anses som en bra biologisk modell för genetiska och utvecklingstoxikologiska studier10,11. Potatis omvandling väsentligt bidragit till förståelsen av molekylära mekanismerna underliggande suberized vävnader genom karakterisering av gener involverade i suberin och vax biosyntes12,13,14 ,15,16,17, suberin monomer transport18 och transkription förordning19. Suberin feruloyl transferas gen, FHT, är en av dessa kännetecknas biosyntetiska gener; dess nedreglering ger upphov till en stark nedsättning av periderm skyddet som är korrelerad med en stark minskning ferulate estrar av suberin och vaxer i potatis knölar14. Samtidigt, i rötter och frön av Arabidopsis visade knockout av dess förmodade orthologue (ASFT/RWP1) också sin roll i producerande alkyl ferulates i suberin20,21. I potatis visade FHT transkriptionell reporter linjen och FHT antikroppen respektive att aktiviteten Promotorn och proteinet är placerade i Exodermisen, Endodermisen, phellogen-derivat och sårade vävnader15.
I detta arbete detalj vi ett protokoll med A. rhizogenes att producera transgena håriga rötter som underhålls i ett vildtyps-shoot, generera sammansatta potatisplantor eller exciderad växa självständigt in vitro. Vi ger också protokollet använder A. tumefaciens för att erhålla fullständig transgena potatisplantor. Som en fallstudie används A. rhizogenes och A. tumefaciens omvandlas med samma binära vektorn att få rötter med FHT arrangören kör GUS reporter genuttryck. Resultaten rapporteras och jämfört.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:559px;" width="559">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1.310.071.21
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Acetosyringone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Acros
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			115540050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Aquarium pump
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Prodac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			MP350
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Autoclave
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Ragpa Strelimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Bacteriological agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1800
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			BAP
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			B0904
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:20px;">
			Beef extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:20px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:20px;">
			1700
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:20px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant growing cabinet
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Nuaire
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Carbenicillin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0109
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Cefotaxime sodium
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			C0111
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			DMSO
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1029310161
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ecotron infors
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			HT
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			29378
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Merck
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1,009,831,011
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Falcon tube
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Control tecnica
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			CFT011500
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferricyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			101001081
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Ferrocyanate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			100979088
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Apiglass
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			ref16
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			GA3
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G7645
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gamborg B5 media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G0210
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Gelrite
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G1101
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Glucosa
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			G5767
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Kanamycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			K1377
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Leukopor tape
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			BSN Leukopor
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			BDF47467
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Lupe
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Wild-Heerbrugg
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M420
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Magnetic shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Agimatic
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			7000243
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MES hydrate
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M2933-25G
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			MgSO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131404
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Microscope
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Olympus
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Minufugue centrifugue 5415R
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Eppendorf
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Murashige and Skoog media
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			M0254.0050
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Na2HPO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131679
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NAA
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			N0903
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaCl
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			131659
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NaH2PO4
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			58282
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			NightSea Stereo
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			SFA Moonting Adapter
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Parafilm
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			PRFL-001-001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Peptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1616
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Petri dishes (90 x 14)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Anorsa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200200
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			pHmetre
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Crison
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Phytotron
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Inkoa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			RFTI-R5485
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Plant Agar
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			P1001
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Refrigeratot
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Liebherr Medline
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Rifampicin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Duchefa
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			R0146
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectinomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			59007
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Spectrophotometer
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Shimadzu
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Square plates (120 x 120)
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Deltalab
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			200204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Streptomycin
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			S6501
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:22px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:161px;height:22px;">
			Panreac
			</td>
			<td style="width:101px;height:22px;">
			131621
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:22px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical blades
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Swann-Morton
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			201
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Surgical needle
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			NIPRO
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			015/0204
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triptone
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1612
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Triton
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Serva
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			37240
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Unimax 1010 shaker
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Heidolph
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Vacuum
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Dinko
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:63px;">
			x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)
			</td>
			<td style="width:161px;height:63px;">
			Biosynth
			</td>
			<td style="width:101px;height:63px;">
			B-7398
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:63px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Yeast extract
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Lab Conda
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1702.00
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:216px;height:21px;">
			Zeatin riboside
			</td>
			<td style="width:161px;height:21px;">
			Sigma
			</td>
			<td style="width:101px;height:21px;">
			1001042850
			</td>
			<td nowrap="nowrap" style="width:80px;height:21px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of potato and the promoter activity of a suberin gene by gus staining

Agrobacterium sp. är en av de mest använda metoderna för att erhålla transgena växter har förmågan att överföra och integrera sina egna T-DNA i växtens arvsmassa. Här presenterar vi två omvandling system för att genetiskt modifiera potatisplantor (Solanumtuberosum). I A. tumefaciens förvandling, bladen är smittade, de transformerade cellerna väljs och en ny komplett bearbetade anläggning regenereras med fytohormoner i 18 veckor. I A. rhizogenes förvandling, stjälkar är smittade genom att injicera bakterier med en nål, nytt framkommit transformerad hårig rötterna upptäcks med en röd fluorescerande markör och icke-omvandlad rötter tas bort. I 5-6 veckor är resulterande anläggningen sammansatt av en vildtyp skjuta med fullt utvecklad transformerad håriga rötter. För att öka biomassa, kan omvandlas hårig rötterna censurerade och själv förökat. Vi ansökte båda Agrobacterium -medierad omvandling metoder för att få rötter uttrycker GUS reporter genen drivs av suberin biosyntetiska gen främjare. De GUS färgningsproceduren tillhandahålls och tillåter cell lokaliseringen av promotorn induktionen. I båda metoderna visade transformerad potatis rötterna GUS färgning i suberized Endodermisen och exodermis, och dessutom i A. rhizogenes omvandlas rötter aktiviteten GUS upptäcktes också i uppkomsten av laterala rötter. Dessa resultat tyder på att A. rhizogenes kan vara ett snabbt alternativa verktyg att studera gener som uttrycks i rötter.

Agrobacterium rhizogenes -medierad potatis transformation
I detta manuskript presenteras det stegvisa förfarandet ställa in att få transformerade rot med A. rhizogenes . Figur 1 presenterar en översikt av förfarandet, som helt och hållet tar omkring 5-6 veckor (injektion av A. rhizogenes att erhålla fullt utvecklad håriga rötter)....

Watch this Scientific Journal Video about Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining at JoVE.c

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Agrobacterium tumefaciens och Agrobacterium rhizogenes-medierad omvandling av potatis och en Suberin gen av GUS Staining arrangören aktivitet

Här presenterar vi två protokoll för att omvandla potatisplantor. Agrobacterium tumefaciens omvandling leder till en komplett transgena anläggning medan den Agrobacterium rhizogenes producerar transgena håriga rötter i en vildtyp skjuta som kan själv förökade. Vi upptäcker då arrangören aktivitet av GUS färgning i de transformerade rötterna.

Agrobacterium sp. is one of the most widely used methods to obtain transgenic plants as it has the ability to transfer and integrate its own T-DNA into ...

Den agrobacteriummedierade omvandlingen är en enkel metod för att producera genetiskt modifierade potatisplantor. För att förstå specifika genfunktioner och deras bidrag till organfysiologi. Transformation by agrobacterium rhizogenes är ett robust verktyg för att snabbt bedöma genfunktionsrötter, eftersom liknande resultat kan erhållas genom agrobacterium tumefaciens-omvandling.Visar detta förfarande kommer att Sandra Fernandez-Pinan, en post-doc, och Jennifer Lopez, en maste5r student från vårt labb. Börja med att odla en enda agrobacterium koloni över natten i fem milliliter jästextrakt buljong, eller YEB medium, kompletteras med antibiotika i en 50 milliliter centrifugrör på 28 grader Celsius, vid 200 rotationer per minut. För a-tumefaciens omvandling, mäta den optiska densiteten nästa morgon.När den optiska densiteten vid 600 nanometer, eller OD 600 når 0,6 till en, centrifug en milliliter av agrobacteriumkulturen och resuspend pelleten i en milliliter färskt YEB medium utan antibiotika. Efter den andra tvätten, resuspend pelleten i färskt YEB medium utan antibiotika, till lämplig koncentration för att få en slutlig OD 600 av 0,8, och placera bakteriecellerna på is. För växtomvandling med hjälp av A.rhizogenes, noggrant överföra en donator växt från en 2MS medium kultur till en 120 av 120 millimeter kvadratplatta, och använda en kirurgisk nål för att injicera tre mikroliter från en A.rhyzogenes kultur till olika stam internodder som möjligt.Sedan omedelbart överföra hela anläggningen till en ny fyrkantig platta som innehåller fast MS medium, kompletterad med 0,1 millimolar acetosyringone. Efter att ha placerat en andra anläggning på samma platta, omvandlas på samma sätt, försegla plattan med kirurgisk tejp, och placera plattan vertikalt inuti ett tillväxtskåp i fyra dagar. Överför växten till en kvadratisk platta med MS-medium kompletterat med cefotaximenatrium för att döda A.rhizogenerna och placera den förseglade plattan vertikalt inuti ett tillväxtskåp i fyra dagar.Efter 10 till 12 dagar kommer nya håriga rötter att dyka upp. Deras omvandling kan bekräftas av fluorescerande stereomikroskop. Vid denna tid, punktskatt de inhemska rötterna av varje växt, och överföra växterna till en ny kvadratisk platta med MS-medium, kompletterad med cefotaxime natrium för att döda A.rhizogenes.För att erhålla en sammansatt växt, låt de transgena håriga rötterna växa i ytterligare tre till fyra veckor i MS-mediet, kompletterat med cefotaxime natrium. För växtomvandling med hjälp av A.tumefaciens. Skär och placera ett blad från en tre till fyra veckor gammal växt i en petriskål, och använd en skalpell för att göra en till tre tvärgående nedskärningar från mitten av bladet till kanterna utan att skära bitarna av bladet.och att utesluta petiole. Placera omedelbart bladet i en petriskål som innehåller 10 milliliter färskt 2MS flytande medium, abaxial sida upp, och täck plattan. Tillsätt snabbt 80 mikroliter av A.tumefaciens-kulturen till det flytande mediet och rör försiktigt om mediet i en minut för att homogent fördela den bakteriella lösningen.Sedan försiktigt försegla och täck plattan med aluminiumfolie för en två dagars inkubation i en 24-graders Celsius kammare. Vid slutet av omvandlingsperioden överför bladen abaxial-sida upp, till det känslokalla-inducerande mediet, skrapat med pincett för en veckas inkubation i tillväxtskåpet. I slutet av inkuberingen, överföra bladen, abaxial-sida upp, på pincett-skrapade skjuta inducerande medium, och inkubera bladen i ett tillväxtskåp.När de framstående rännorna är ungefär två centimeter höga, skär tre framväxande rännorna från varje känslokall. Placera upp till fem olika rännaomvandlingshändelser till enskilda odlingskolvar som innehåller MG-medium kompletterat med cefotaximenatrium för att tillåta böka, och märk underuppsättningen som lämplig för en inkubering på tre till fyra veckor i tillväxtskåpet tills rännorna är kraftiga. I slutet av inkubationen väljer du den mest kraftfulla växten av varje händelse och skär de apikala segmenten av rännan med tre till fyra internoder från varje planta.Placera segmenten i en odlingskolv som innehåller 2MS-medium kompletterat med cefotaxime-natrium och odla växterna tills de utvecklar kraftiga rännor och rötter. För att utföra en beta-glukuronidase eller GUS histochemical reporter gen assay, fixa rötterna från en två till tre veckors in vitro växtkultur med 90%kyld aceton i 20 minuter på is. Vid slutet av fixeringen, tvätta rötterna två gånger i destillerat vatten och behandla rötterna med färsk GUS-färgningslösning under vakuum i 20 minuter.I slutet av vakuumbehandlingen placerar du rötterna vid 37 grader Celsius i mörkret i ungefär fyra timmar. När en blå färg är synlig, tvätta rötterna två gånger med 70%etanol, och visualisera färgningen under ett ljust fältmikroskop. Transformerade håriga rötter uppvisar en röd florescence när den är upplyst med grönt ljus, medan negativ kontroll otransformad agrobacterium visar inga sådana florescence, som anger lämpligheten av DS röda omvandlingen markör för att identifiera transgena håriga rötter.Här visas GUS-färgning i rötter av transgena växter som erhållits av A.tumefaciens och transgena håriga rötter som erhållits genom A.rhizogenes. Som observerats, rötter omvandlas med A, tumefaciens och odlas in vitro, visa blå färgning i endodermis, ett celllager mellan cortex och stele. I mer utvecklade rötter är den blå märkningen ojämn i det yttre lagret, motsvarande exodermis.I omvandlas håriga rötter som erhållits av A.rhizogenes, och odlas i hydroponics, GUS markören är specifikt ligger inom endodermis i uppkomsten av laterala rötter i de sårade områdena och i exodermis. Förutom att vara en snabb metod, de transgena rötter som erhållits med agrobacterium rhizogenes bar också DNA från rot-inducerande plasmid, som kan avreglera vissa direktkontrollerade processer. De transgena håriga rötter som erhålls med agrobacterium rhizogenes kan upprätthållas medan de skjuter, men alternativt kan på plats tills förökas in vitro för massiv transitering produktion.Potatisomvandlingen ger ett bra verktyg för att kontrollera genfunktionen och promotorns aktivering, och även för att ta fram metodregler i en art av högt agronomiskt intresse. Den genetiskt modifierade organismen bör kasseras på ett säkert sätt efter användning för att undvika miljöförorening. Dessutom innehåller gaslösning giftiga cyanid derivat, så slitage skydd och kassera lösningen på ett säkert sätt.

Research

JoVE Journal

Environment

Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining

Determination of Microbial Extracellular Enzyme Activity in Waters, Soils, and Sediments using High Throughput Microplate Assays

Fastställande av mikrobiell extracellulär enzymaktivitet i Vatten, Jord och sediment med hjälp av hög genomströmning mikroplattor Analyser

Much of the nutrient cycling and carbon  processing in natural environments occurs through the activity of extracellular  enzymes released by ...

Optimized Negative Staining: a High-throughput Protocol for Examining Small and Asymmetric Protein Structure by Electron Microscopy

Optimerad Negativ Färgning: a hög kapacitet protokoll för prövningen Liten och Asymmetric Protein Structure genom elektronmikroskopi

Structural determination of proteins is rather challenging for proteins with molecular masses between 40 - 200 kDa. Considering that more than half of ...

Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

Transient genuttryck i Tobaks använder Gibson församling och Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

Design och konstruktion av en Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

En fisk-matning Laboratorie Bioassay att bedöma Antipredatory aktivitet av sekundära metaboliter från vävnader av marina organismer

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metod 1615 Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. Del III. Virus Detection med RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Spotting Cheetahs: Identifying Individuals by Their Footprints

Spotting Cheetahs: identifiera individer av deras fotspår

The cheetah (Acinonyx jubatus) is Africa's most endangered large felid and listed as Vulnerable with a declining population trend by the IUCN1. It ranges ...

Simultaneous DNA-RNA Extraction from Coastal Sediments and Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Real-time PCR

Samtidig DNA-RNA-extraktion från kustsediment och kvantifiering av 16S rRNA gener och transkript av Real-time PCR

Real Time Polymerase Chain Reaction also known as quantitative PCR (q-PCR) is a widely used tool in microbial ecology to quantify gene abundances of ...

Empirical, Metagenomic, and Computational Techniques Illuminate the Mechanisms by which Fungicides Compromise Bee Health

Empirisk, gjorts och beräkningstekniker belysa mekanismerna genom vilka fungicider kompromiss bihälsa

Growers often use fungicide sprays during bloom to protect crops against disease, which exposes bees to fungicide residues. Although considered ...

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Den Barnacle Balanus improvisus som Marina modell - odling och genuttryck

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...