Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ونحن نشكر سيبا اتسيدي للدعم التقني. C.S.C. معتمد من قبل 1R61DA047032 منحة المعاهد الوطنية للصحة.

يوفر هذا البروتوكول تحسين الإرشادات خطوة بخطوة لأداء أتاك-seq لخلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، من المواد بدءاً من الدم كله من خلال تحليل البيانات (الشكل 1).
1-عزل خلايا CD4 + تي الخلايا من الدم كله
ملاحظة: انطلاق المواد لهذا البروتوكول 15 مل دم...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

ينص البروتوكول أتاك-seq المعدلة المقدمة في هذه المقالة النتائج استنساخه مع الحد الأدنى من التلوث الحمض النووي mitochondrial. البروتوكول قد المستخدمة لنجاح تميز الكروماتين العمارة البشرية الأولية ببمكس10، وحيدات البشرية، والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور)، وخطوط الخلية الميلانوما ...

سرعان ما أصبحت المقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) الأسلوب الرائد لاستجواب العمارة الكروماتين. أتاك-seq يمكن تحديد مناطق الكروماتين موجوداً من خلال عملية تاجمينتيشن، وتفتيت ووضع علامات على الحمض النووي من الإنزيم نفسه، لإنتاج المكتبات التي يمكن تحديد تسلسل الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله. هو توسط هذه العملية تاجمينتاتيون ترانسبوساسي Tn5 مفرط، مما يقطع فقط فتح مناطق الكروماتين بسبب عائق الفراغية نوكليوسوميك. كما أنه يخفض، ترانسبوساسي Tn5 أيضا بإدراج تسلسل المحولات التي تسمح ببناء مكتبة السريع ببكر وتسلسل الجيل القادم من الكروماتين موجوداً على نطاق الجينوم1،2.
وقد أصبح أتاك-seq الأسلوب المفضل لتحديد مناطق الكروماتين إمكانية الوصول إلى سبب بروتوكول بسيط وسريع نسبيا، ونوعية ونطاق المعلومات التي يمكن تحديدها من نتائجها، وكمية صغيرة من ابتداء من المواد المطلوبة. مقابل seq الدناز3 (الذي يقيس أيضا إمكانية الحصول على نطاق الجينوم الكروماتين)، seq منسى4 (الذي يحدد مواقف نوكليوسومي في المناطق المفتوحة الجينوم)، وفورمالدهايد بوساطة فير-seq5، أتاك-seq أسرع، أرخص وأكثر استنساخه1. كما أنها أكثر حساسية، العمل مع ابتداء من المواد لعدد قليل من نويات 500، بالمقارنة مع الأنوية 50 مليون المطلوب ل seq الدناز3. وقد أتاك-seq أيضا القدرة على تقديم مزيد من المعلومات حول بنية الكروماتين من الأساليب الأخرى، بما في ذلك مناطق ملزمة عامل النسخ، نوكليوسومي لتحديد المواقع، و مناطق الكروماتين المفتوحة1. تم التحقق من بروتوكولات seq أتاك الفعال، خلية واحدة، تقديم معلومات عن العمارة الكروماتين في خلية واحدة المستوى6،7.
وقد استخدمت أتاك-seq لتوصيف العمارة الكروماتين عبر طائفة واسعة من أنواع البحوث والخلايا، بما في ذلك النباتات8،9من البشر، والعديد من الكائنات الحية الأخرى. كما كان حاسما في تحديد لائحة جينية للمرض الدول7. ومع ذلك، يشمل البروتوكول أتاك-seq الأكثر استخداماً العيب الرئيسي التلوث قراءة تسلسل الحمض النووي. في بعض مجموعات البيانات، ويمكن أن يكون هذا مستوى التلوث تصل إلى 60 في المائة من تسلسل النتائج1. وهناك جهد متضافر في الحقل لتقليل هذه القراءات المتقدرية تلويث بغية السماح للتطبيق أكثر كفاءة من أتاك-seq7،،من1011. هنا نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة يقلل من معدل التلوث الحمض النووي mitochondrial إلى 3 في المائة فقط، مما يتيح الحد من حوالي 50% في تسلسل تكاليف10. أصبح هذا ممكناً من خلال عملية مبسطة اللمفاويات عزل خلايا CD4 + والتنشيط ومؤقت تحلل تحسن مهم في التقليل من تلوث الحمض النووي mitochondrial.
وقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول seq موديفيداتاك مع مجموعة واسعة نطاق من الخلايا الابتدائية، بما فيها البشرية الدم المحيطي الابتدائي الخلايا وحيدات النوى (ببمكس)10ووحيدات الأساسية البشرية والخلايا الجذعية الماوس (غير منشور). فقد استخدمت أيضا بنجاح استجواب خطوط خلايا سرطان الجلد في شاشة يكرر المتناوب قصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) متفاوت المسافات من العناصر غير الترميز11. بالإضافة إلى ذلك، توفر الحزمة تحليل البيانات المبينة في هذا البروتوكول، وقدمت في GitHub الباحثين الجدد وذوي الخبرة مع أدوات لتحليل البيانات أتاك-seq. أتاك-seq هو التحليل الأكثر فعالية لتعيين الكروماتين إمكانية الوصول عبر جينوم أكمله والتعديلات على البروتوكول القائمة التي يتم إدخالها هنا ستسمح للباحثين لإنتاج بيانات عالية الجودة مع انخفاض التلوث الحمض النووي mitochondrial، تخفيض تكاليف التسلسل وتحسين الإنتاجية أتاك-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

وأصبح أتاك-seq منهجية مستخدمة على نطاق واسع في دراسة التخلق بسبب نهجها سريعة وبسيطة لرسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً. في هذه الورقة نقدم بروتوكولا أتاك-seq محسنة تقلل تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي:. بينما ناضلت البروتوكولات أتاك-seq السابقة مع يقرأ بمعدل 50% تلويث الحمض النووي، تحلل الأمثل المخزن المؤقت في هذا البروتوكول يقلل من تلوث الحمض النووي mitochondrial إلى متوسط 3%. يسمح هذا البروتوكول أتاك-seq محسنة لتخفيض تكلفة التسلسل قريب 50%. ونحن تثبت كيف يمكن إعداد هذه المكتبات أتاك-seq عالية الجودة من تنشيط خلايا CD4 + الخلايا الليمفاوية، توفير إرشادات خطوة بخطوة من اللمفاويات عزل خلايا CD4 + من الدم كله من خلال تحليل البيانات. هذا البروتوكول أتاك-seq تحسين قد تم التحقق من صحتها في طائفة واسعة من أنواع الخلايا، وسوف يكون للاستخدام الفوري للباحثين الذين يدرسون إمكانية الكروماتين.

من 15 مل دم كله جديدة، ينشئ هذا البروتوكول في وسط خلايا CD4 + "تي" 1 مليون. وهذه يمكن المجمدة للمعالجة فيما بعد أو استخدامها على الفور. الجدوى لخلايا CD4 + T، طازجة أو المذابة، كان دائماً > 95%. يسمح هذا الأسلوب لعزل خلايا CD4 + T للمرونة في الوقت مصدر المواد وجمع. وتنتج هذا البروتوكول أ...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتنفيذ مقايسة الكروماتين ترانسبوساسي موجوداً التسلسل (أتاك-seq) على تنشيط اللمفاويات CD4 + البشرية. لقد تم تعديل البروتوكول للتقليل من تلوث الميتوكوندريا الحمض النووي ما يلي: من 50% إلى 3% من خلال إدخال مخزن مؤقت تحلل الجديدة.

أتاك-seq المقايسة مع الحمض النووي منخفضة التلوث من الابتدائي البشرية CD4 + تي الخلايا اللمفية

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

هذا البروتوكول تعديل ATAC-seq يقدم عازلة تحلل جديدة أن يقلل من تلويث يقرأ الميتوكوندريا من 50٪ إلى أقل من 3٪، وسوف انخفاض التلوث الميتوكوندريا يسمح للباحثين لأداء أكثر كفاءة ATAC-seq مع انخفاض 50٪ في تكاليف التسلسل. لقد تم التحقق من صحة هذا البروتوكول الجديد ATAC-seq في PBMCs الأساسية البشرية، monocytes الإنسان الأولية، الخلايا الماوس تقشر، وخطوط خلايا سرطان الجلد. ونحن نعتقد أنه سيكون فعالا في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا.التقليل من فقدان العينة أثناء تنشيط الخلية وعملية الاختيار أمر بالغ الأهمية للحصول على نتائج عالية الجودة مع ATAC-seq. سوف نبين كيفية التعامل مع أعداد صغيرة من الخلايا من عينات ثمينة باستخدام معدات المختبرات الأساسية. للبدء، ذوبان قارورة واحدة من خلايا CD4 + T المعزولة سابقا في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب الجليد للتو.ثم نقل بلطف الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على تسعة ملليلتر من دورة RPMI كاملة قبل تسخينها. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 مرة G، وأربع درجات مئوية، لمدة ست دقائق. ثم تجاهل فائقة، وإعادة بلطف بيليه في مليلتر اثنين من دورة في الدقيقة كاملة.بعد تكرار الطرد المركزي، والتخلص من عظمى، وبلطف إعادة تعليق الخلايا في 0.5 ملليلتر من دورة في الدقيقة كاملة. استخدم مقياس الدم لحساب الخلايا. باستخدام دورة في الدقيقة كاملة، ضبط كثافة تعليق الخلية إلى لوحة 50، 000 CD4 + الخلايا في 200 ميكرولترات لكل بئر من 96 جيدا جولة أسفل لوحة.ثم, لإعداد الخرز المغناطيسي, aliquot 12.5 ميكرولترات من الإنسان T-المنشط CD3/CD28 الخرز لكل ATAC-seq عينة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة ملليلتر واحد من 1X PBS إلى الأنبوب، ووضعها على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة لغسل الخرز. إزالة بعناية وتجاهل نابيرانت واضحة، وإزالة أنبوب من المغناطيس.Resuspend الخرز في 13 ميكرولترات من دورة في الدقيقة كاملة لكل ATAC-seq عينة. لتنشيط خلايا CD4 + T مع التركيز المعدل، وجمع 500،000 خلية في 2.1 ملليلتر من متوسطة كاملة RPMI في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. إضافة 12.5 ميكرولترات من الخرز T-Activator الإنسان، أعدت وغسلها في الخطوات السابقة، ومزيج بلطف عن طريق عكس الأنبوب.ثم نقل بلطف الخلايا، مع الخرز، إلى خزان معقمة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، لوحة 200 ميكرولترات من الخلايا مع الخرز في بئر من لوحة 96-جيدا الجولة القاع، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون حاضنة لمدة 48 ساعة. بعد الحضانة كاملة، الطرد المركزي لوحة في 423 مرات G، ودرجة حرارة الغرفة، لمدة ثماني دقائق.إزالة 100 ميكرولترات من المتوسط من كل بئر، وجمعها في أنبوب مخروطي قبل التخلص منها، من أجل تأكيد عدم فقدان الخرز. ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 100 ميكرولترات المتبقية من المتوسطة، وجمع كل شيء في أنبوب 1.5 ملليلتر. لعزل CD4 + الخلايا، إضافة 50 ميكرولترات من الخرز CD4 مترافق غسلها مسبقا إلى 500، 000 خلية في ملليلتر واحد من دورة في الدقيقة كاملة، وعكس لمزيج.احتضان لمدة 20 دقيقة في أربع درجات مئوية، في حين نفض الغبار باليد كل ست دقائق لخلط. ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقتين ، حتى يكون فائق الوضوح واضحًا ، ثم قم بإزالةه وتجاهله. إزالة أنبوب من المغناطيس.غسل الخلايا مرتبطة حبة عن طريق إعادة تعليق لهم في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، بالإضافة إلى 2٪ FCS، ووضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة. تجاهل اضحة فائقة، وتكرار هذه العملية لما مجموعه ثلاثة يغسل. بعد الغسيل النهائي، ضع الأنبوب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.إزالته، والتخلص من عظمى، ووضع بيليه على الجليد. بعد ذلك ، لأداء عزل النواة ، resuspend الخرز والخلايا في 50 ميكرولترات من عازلة التحلل البارد ، والطرد المركزي على الفور في 500 G ، أربع درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق. إزالة وتجاهل ناظر.لأداء رد فعل transposase، resuspend بيليه نوى معزولة مع 50 ميكرولترات من مزيج تراباسي Tn5. احتضان في دراجة الحرارة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية، مع غطاء تعيين إلى 40 درجة مئوية، ومن ثم عقد في أربع درجات مئوية عند الانتهاء. مباشرة بعد الدراجات الحرارية، تنفيذ سريع مقاعد البدلاء أعلى جهاز طرد مركزي تدور إلى أسفل.وضع أنبوب على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة لإزالة الخرز من المنتج. دون إزالة الأنبوب من المغناطيس، نقل فائقة واضحة إلى عمود تنقية الحمض النووي. غسل العمود مرة واحدة مع 250 ميكرولترات من المخزن المؤقت PB، ومرتين مع 750 ميكرولترات من المخزن المؤقت PE.ثم إضافة 10 ميكروليترس من عازلة elution ل elute العينة. قم بإعداد تفاعل التضخيم الأولي لل PCR في أنبوب PCR خال من النوى. ضع أنبوب PCR في الدراجات الحرارية، وتشغيل برنامج تضخيم PCR.ثم أكمل التضخيم النهائي لل PCR لل45 ميكرولترات المتبقية من تفاعل PCR، كما هو موضح في المخطوطة. ضع أنبوب PCR في الدراجات الحرارية وتشغيل البرنامج. بعد التضخيم الكامل، تنقية المكتبات باستخدام مجموعة تنظيف PCR، بعد بروتوكول الشركة المصنعة، والفرز في 25 ميكروليترس من العازلة elution.تسلسل المكتبات المعدة على التسلسل الجيل التالي إلى متوسط عمق القراءة من 42 مليون يقرأ لكل عينة. وقد أدى هذا البروتوكول المحسن ATAC-seq إلى إنتاج مكتبة نهائية تزيد عن نانوغرام واحد لكل ميكرولتر من أجل التسلسل. وأظهرت مراقبة الجودة شظايا الحمض النووي بين 200 و 1،000 زوج قاعدة، وتم إجراء مزيد من التسلسل مع هذه المكتبات عالية الجودة.المكتبات المعدة بعد هذا البروتوكول أظهرت سوى 3٪ من التلوث الميتوكوندريا. نسبة عالية من يقرأ قابلة للاستخدام ثابتة بما فيه الكفاية عبر النسخ المتماثلات البيولوجية. وقد وفر هذا البروتوكول نتائج قابلة للاستنساخ إلى حد كبير عبر النسخ المتماثلة التقنية، فضلاً عن النسخ المتماثلة البيولوجية.بالإضافة إلى ذلك، استغرق هذا البروتوكول 48 ساعة، بدلاً من أسبوع واحد أو أكثر كما هو موضح سابقاً، مما أدى إلى تنشيط متسق وفعال، كما هو موضح من خلال نتائج التسلسل القابلة للتكرار. وعلاوة على ذلك، فإن ذروة ATAC-seq المتوقعة كانت تسمى بدقة من قبل خط التحليل. كشف تحليل النتائج التسلسلية عن تغييرات واضحة في حالة الكروماتين أثناء تنشيط الخلايا T البشرية.تم تحديد مناطق يمكن الوصول إليها بشكل متمايز من الكروماتين المفتوحة بين ست عينات قبل و 48 ساعة بعد التنشيط. تأكد من أن يتم تنفيذ تفاعل الانوية مع الكواشف والمواد المبردة ، من أجل تحقيق أقصى قدر من استعادة النوى السليمة. لدينا العازلة تحلل نويات معدلة هو ألطف على الخلايا، ويقلل من الحمض النووي الميتوكوندريا الملوثة.ونحن نتطلع إلى تطبيق هذا العازل المعدل للتحلل على نظام النيوية الواحدة ATAC-seq أيضا. ونحن نعلم أن هذا البروتوكول سيسمح للباحثين بإنتاج بيانات أعلى جودة من ATAC-seq بتكلفة مخفّض، مما يساعد على إعادة توجيه المجال اللاجيني. البروتوكول هو واضح وسريع، ولا يتطلب أي الكواشف أو الصكوك الخطرة، مما يجعلها في متناول هذه الجديدة من ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

في الموقع وصفها من الحمض النووي النسخ المتماثل في ذبابة الفاكهة الكبار المبايض عن طريق ايدو تلطيخ

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

تقييم التلوث الحمض النووي في عينات الحمض النووي الريبي استناداً إلى ريبوسومال الحمض النووي

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

منهجية للكشف عن دقة مثلايشن الحمض النووي

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

عزل، وتسلسلها، وتحليل MicroRNAs خارج الخلية من الخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

لينتيفيروسي تسكت الجينات بوساطة في الزائفة البشرية أعدت في لوحات مرفق منخفضة

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

اشتقاق الأورام والعلاج من الخلايا السرطانية الأولية المعزولة من الساركوما الروماتيزمية الماوس

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

التحليل الخلوي للحمض النووي الثنائي الميكروي والتدفق المضخم للخلايا من Formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المولية

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D متعدد الألوان أداة الحمض النووي الأسماك لدراسة العمارة النووية في الخلايا الأساسية البشرية

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...