Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Vi takker Atsede Siba for teknisk support. C.S.C. understøttes af NIH grant 1R61DA047032.

Denne forbedrede protokol indeholder trinvise instruktioner til at udføre ATAC-seq af CD4 + lymfocytter, fra råvare fuldblod gennem analyse af data (figur 1).
1. isolering af CD4 + T-celler fra fuldblod
Bemærk: Råvaren til denne protokol er 15 mL frisk fuldblod indsamlet ved hjælp af standard procedurer, så kilde af råvaren skal vælges baseret på forskningsbehov. Skalere protokollen efter behov. Pre varm phosphat...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Den ændrede ATAC-seq protokol præsenteret i denne artikel giver reproducerbare resultater med minimal mitokondriel DNA forurening. Protokollen har været vant til med held karakterisere kromatin arkitektur af menneskelige primære PBMC10, humane monocytter, mus dendritiske celler (upubliceret), og kulturperler melanom cell linjer11. Vi forventer denne forbedrede lysis betingelse har potentiale til at arbejde for andre celletyper. Det forventes også, at denne kerner isola...

Assay for transposase-tilgængelige kromatin sekventering (ATAC-FF.) er hurtigt blevet den førende metode til spørgekriterierne kromatin arkitektur. ATAC-seq kan identificere regioner af tilgængelige kromatin gennem processen med tagmentation, fragmentering og mærkning af DNA af det samme enzym til fremstilling af biblioteker som sekvensering kan bestemme kromatin tilgængelighed på tværs af en hel genom. Denne tagmentation proces er medieret af en hyperaktiv Tn5 transposase, som kun skærer åbne områder af kromatin på grund af nucleosomic sterisk hindring. Som det skærer, indsætter Tn5 transposase også sekventering adaptere, der giver mulighed for hurtig bibliotek opbygning af PCR og næste generation sequencing genome-wide tilgængelige kromatin1,2.
ATAC-seq er blevet den foretrukne metode til at bestemme regioner af kromatin tilgængelighed på grund af relativt enkel og hurtig protokol, kvalitet og udvalg af oplysninger, der kan bestemmes ud fra dens resultater, og lille mængde starter materiale kræves. I forhold til DNase-seq3 (som også måler genome-wide kromatin tilgængelighed), MNase-seq4 (som bestemmer nucleosome positioner i åben genom regioner), og at formaldehyd-medieret FAIRE-seq5, ATAC-seq er hurtigere, billigere og mere reproducerbare1. Det er også mere følsomme, arbejder med begyndende materiale af så få som 500 kerner, i forhold til de 50 millioner kerner kræves for DNase-FF.3. ATAC-seq har også evnen til at give flere oplysninger om kromatin arkitektur end andre metoder, herunder regionerne transskription faktor bindende, nucleosome placering og åbne kromatin regioner1. Effektiv, encellede ATAC-seq protokoller er blevet valideret, med oplysninger om kromatin arkitektur på én celle niveau6,7.
ATAC-seq er blevet brugt til at karakterisere kromatin arkitektur på tværs af et bredt spektrum af typer af forskning og celler, herunder planter8, mennesker9og mange andre organismer. Det har også været kritisk at identificere epigenetisk regulering af sygdom stater7. Den mest udbredte ATAC-seq protokol indeholder dog den store ulempe ved forurening sekventering læsninger fra mitokondrie-DNA. I nogle datasæt, kan denne forurening niveau være så høj som 60% af sekventering resultater1. Der er en samordnet indsats i feltet for at reducere disse kontaminerende mitokondrie læser for at muliggøre en mere effektiv anvendelse af ATAC-FF.7,10,11. Her præsenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokol, der reducerer den mitokondrielle DNA forurening sats til kun 3%, så reduktion på omkring 50% i sekventering omkostninger10. Dette er gjort muligt af en strømlinet proces af CD4 + lymfocyt isolation og aktivering og en forbedret lysisbuffer, der er kritisk i at minimere mitokondriel DNA forurening.
Denne modifiedATAC-seq protokol er blevet valideret med en bred vifte af primærelementer, herunder menneskelige primære perifert blod mononukleære celler (PBMC)10, menneskelig primær monocytter og mus dendritiske celler (upubliceret). Det har også været anvendt med succes til at afhøre melanom cellelinjer i et klyngemiljø regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) skærm af ikke-kodende elementer11. Derudover giver analyse datapakke beskrevet i denne protokol og leveres på GitHub nye og erfarne forskere med værktøjer til at analysere ATAC-seq data. ATAC-seq er den mest effektive assay at kortlægge kromatin tilgængelighed på tværs af en hel genom, og ændringer i den eksisterende protokol, der er indført her giver forskere til at producere data af høj kvalitet med lav mitokondriel DNA forurening, at reducere sekventering omkostninger og forbedre ATAC-seq overførselshastighed.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq er blevet en meget anvendt metode i studiet af Epigenetik på grund af sin hurtige og enkle tilgang til kortlægning genome-wide tilgængelige kromatin. I dette papir præsenterer vi en forbedret ATAC-seq-protokol, der reducerer forurener mitokondriel DNA læser. Mens tidligere ATAC-seq protokoller har kæmpet med læser et gennemsnit på 50% forurener mitokondrie-DNA, den optimerede lysisbuffer indført i denne protokol reducerer mitokondriel DNA forurening til et gennemsnit på 3%. Denne forbedrede ATAC-seq protokol giver mulighed for en i nærheden af 50% reduktion i sekventering omkostninger. Vi demonstrere, hvordan disse høj kvalitet ATAC-seq biblioteker kan fremstilles af aktiverede CD4 + lymfocytter, giver trinvise instruktioner fra CD4 + lymfocyt isolation fra fuldblod gennem analyse af data. Denne forbedrede ATAC-seq protokol er blevet valideret i en lang række celletyper og vil være til umiddelbar nytte for forskere studerer kromatin tilgængelighed.

Fra 15 mL frisk fuldblod genererer denne protokol et gennemsnit på 1 million CD4 + T-celler. Disse kan nedfryses til senere behandling eller anvendes straks. Levedygtighed af CD4 + T-celler, friske eller optøede, var konsekvent > 95%. Denne metode af CD4 + T celle isolation giver mulighed for fleksibilitet i kilde materiale og samling tid. Denne forbedrede ATAC-seq protokol producerer en endelige bibliotek på mere end 1 ng/µL til sekvensering. Kvalitetskontrol, der udføres ved hjælp...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Vi præsenterer her, en protokol for at udføre en analyse for transposase-tilgængelige kromatin sekventering (ATAC-seq) på aktiverede CD4 + humane lymfocytter. Protokollen er blevet ændret for at minimere kontaminering af mitokondriel DNA læsninger fra 50% til 3% gennem indførelse af en ny lysisbuffer.

ATAC-seq Assay med lav mitokondriel DNA forurening fra primære menneskelige CD4 + T-lymfocytter

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Denne modificerede ATAC-seq protokol introducerer en ny lysis buffer, der reducerer forurenende mitokondriel læser fra 50% til mindre end 3%Den faldt mitokondriel forurening vil give forskerne mulighed for at udføre mere effektiv ATAC-seq med en 50% fald i sekventering omkostninger. Vi har valideret denne nye ATAC-seq protokol i humane primære PBMCs, menneskelige primære monocytter, mus dendritiske celler, og melanom cellelinjer. Vi mener, at det vil være effektivt i en bred vifte af celletyper.Minimering af prøvetab under celleaktiverings- og udvælgelsesprocessen er afgørende for at opnå resultater af høj kvalitet med ATAC-seq. Vi vil demonstrere, hvordan man håndterer et lille antal celler fra dyrebare prøver ved hjælp af grundlæggende laboratorieudstyr. Til at begynde, tø et hætteglas af tidligere isolerede CD4 + T-celler i en 37-graders Celsius vandbad, indtil isen lige er smeltet.Derefter forsigtigt overføre cellerne til en 15-milliliter konisk rør, der indeholder ni milliliter forvarmte komplet RPMI. Centrifuge cellerne på 1, 500 gange G, og fire grader Celsius, i seks minutter. Derefter kasseres supernatant, og forsigtigt resuspend pellet i to milliliter komplet RPMI.Efter at centrifugering er gentaget, kasseres supernatanten, og cellerne skal forsigtigt opsbruges i 0,5 milliliter komplet RPMI. Brug et hæmocytometer til at tælle cellerne. Ved hjælp af komplet RPMI justeres cellesuspensionstætheden til plade 50.000 CD4+celler i 200 mikroliter pr. brønd på en 96-brønd rundbundsplade.Derefter, at forberede magnetiske perler, aliquot 12,5 mikroliter af Human T-Activator CD3/CD28 perler pr ATAC-seq prøve til en 1,5 milliliter rør. Tilføj en milliliter 1x PBS til røret, og læg den på en magnet i et minut for at vaske perlerne. Fjern og kassér forsigtigt den klare supernatant, og fjern røret fra magneten.Resuspend perlerne i 13 mikroliter af komplet RPMI pr ATAC-seq prøve. For at aktivere CD4+T-cellerne med den justerede koncentration indsamles 500.000 celler i 2,1 milliliter komplet RPMI-medium i et 15-milliliter konisk rør. Tilsæt 12,5 mikroliter af Human T-Activator perler, forberedt og vasket i tidligere trin, og bland forsigtigt ved at vende røret.Derefter forsigtigt overføre cellerne, med perler, til en steril reservoir. Ved hjælp af en multi-kanal pipette, plade 200 mikroliter af celler med perler pr brønd af en rund-bund 96-godt plade, og inkubere i en 37-graders Celsius, 5% CO2 inkubator i 48 timer. Efter fuldstændig inkubation centrifuges pladen ved 423 gange G og rumtemperatur i otte minutter.Fjern 100 mikroliter af medium fra hver brønd, og opsaml det i et konisk rør, før du kasserer, for at bekræfte, at der ikke er tale om tab af perle. Derefter resuspend cell pellet i de resterende 100 mikroliter af medium, og indsamle alt i en 1,5-milliliter rør. For at isolere CD4+celler skal der tilsættes 50 mikroliter af forvaskede CD4 konjugerede perler til 500, 000 celler i en milliliter komplet RPMI og inverteres for at blande.Inkuber i 20 minutter ved fire grader Celsius, mens håndsvippede hvert sjette minut for at blande. Placer røret på magneten i to minutter, indtil supernatanten er klar, og fjern og kassér det. Fjern røret fra magneten.Vask de perlebundne celler ved at opslænne dem i en milliliter PBS plus 2%FCS, og sæt røret tilbage på magneten i et minut. Kassér den klare supernatant, og gentag denne proces for i alt tre vaske. Efter den endelige vask, placere røret på magneten i et minut.Fjern det, kassér supernatant, og læg pellet på is. Dernæst for at udføre kerneisolering, resuspend perlerne og cellerne i 50 mikroliter af kold lysis buffer, og centrifuge straks ved 500 G, fire grader Celsius, i 10 minutter. Fjern og kassér supernatanten.For at udføre transposase-reaktionen skal den isolerede kernepille genbruges med 50 mikroliter Tn5 transposaseblanding. Inkuberes i en termocyr i 30 minutter ved 37 grader Celsius, med låget sat til 40 grader Celsius, og hold derefter ved fire grader Celsius, når det er færdigt. Umiddelbart efter thermocycling, udføre en hurtig bænk-top centrifuge spin-down.Placer røret på magneten i et minut for at fjerne perlerne fra produktet. Uden at fjerne røret fra magneten, overføre den klare supernatant til en DNA rensning kolonne. Kolonnen vaskes én gang med 250 mikroliter PB-buffer og to gange med 750 mikroliter PE-buffer.Derefter tilsættes 10 mikroliter af elution buffer til elute prøven. Konfigurer den indledende PCR-forstærkningsreaktion i et nukleosfri PCR-rør. Placer PCR-røret i termocyren, og kør PCR-forstærkningsprogrammet.Gennemfør derefter den endelige PCR-forstærkning af de resterende 45 mikroliter PCR-reaktion, som beskrevet i manuskriptet. Placer PCR-røret i termocyren, og kør programmet. Efter fuldstændig forstærkning renses bibliotekerne ved hjælp af et PCR-oprydningssæt efter producentens protokol, der fremkalder 25 mikroliter af elution-bufferen.Sekvenser de forberedte biblioteker på en næste generations sequencer til en gennemsnitlig læsedybde på 42 millioner læsninger pr. prøve. Denne forbedrede ATAC-seq-protokol producerede et endeligt bibliotek med mere end ét nanogram pr. mikroliter til sekventering. Kvalitetskontrol viste DNA fragmenter mellem 200 og 1, 000 base par, og yderligere sekventering blev udført med disse høj kvalitet biblioteker.Biblioteker udarbejdet efter denne protokol viste kun 3% mitokondriel forurening. Den høje procentdel af brugbare aflæsninger er tilstrækkelig konstant på tværs af biologiske replikater. Denne protokol gav meget reproducerbare resultater på tværs af tekniske replikater, samt biologiske replikater.Derudover tog denne protokol 48 timer i stedet for en uge eller mere som tidligere beskrevet, hvilket resulterede i konsekvent og effektiv aktivering, som det fremgår af reproducerbare sekvenseringsresultater. Desuden blev de forventede ATAC-seq-toppe nøjagtigt kaldt af analyserørledningen. Sekventering resultatanalyse afslørede klare ændringer i kromatin tilstand under human T celle aktivering.Differentieret tilgængelige områder med åbent kromatin blev identificeret mellem seks prøver før og 48 timer efter aktivering. Sørg for, at kernelyisreaktionen udføres med kølede reagenser og materialer for at maksimere genvindingen af intakte kerner. Vores modificerede kerner lysis buffer er blidere på cellerne, og minimerer forurenende mitokondrielle DNA.Vi ser frem til denne modificerede lysis buffer anvendes på enkelt-kerner ATAC-seq så godt. Vi ved, at denne protokol vil give forskerne mulighed for at producere ATAC-seq-data af højere kvalitet til nedsat pris, hvilket hjælper med at videresende det epigenetiske felt. Protokollen er ligetil, hurtig og kræver ingen farlige reagenser eller instrumenter, hvilket gør den let tilgængelig for de nye til ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og brug af en Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution Bacteria Under antibiotikum Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Mærkning af mitokondrie-DNA Replication i Drosophila Adult Ovarier af Edu Farvning

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Vurdering af DNA forurening i RNA prøver baseret på ribosomale DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kortlægning Genome-wide tilgængelige kromatin i primære humane T lymfocytter af ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Metoder til nøjagtig detektering af mitokondrie-DNA methylering

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isolering, sekventering og analysere ekstracellulære MicroRNA fra humane mesenkymale stamceller

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentiviral medieret genhæmning i humant Pseudoø fremstillet i lave fastgørelses plader

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Tumorsphere Afberegning og behandling fra primære tumor celler isoleret fra mus Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Mikrosatellitdna-genotypebestemmelse og flow cytometri-Ploidy analyser af formalin-fast paraffin-indlejret Hydatidiform Molarvæv

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Multicolor DNA FISH Tool til at studere nuklear arkitektur i humane primære celler

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...