Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Wij danken Atsede Siba voor technische ondersteuning. CSC wordt ondersteund door de NIH grant 1R61DA047032.

Dit verbeterde protocol bevat stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van ATAC-seq van CD4 +-lymfocyten, van de grondstof van volbloed door middel van data-analyse (Figuur 1).
1. isolatie van CD4 + T cellen van volbloed
Opmerking: De grondstof voor dit protocol is 15 mL vers volledig bloed verzameld met behulp van standaardprocedures, zodat de bron van de grondstoffen worden geselecteerd op basis van onderzoek vereist...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNase-seq:+a+high-resolution+technique+for+mapping+active+gene+regulatory+elements+across+the+genome+from+mammalian+cells.">DNase-seq: a high-resolution technique for mapping active gene regulatory elements across the genome from mammalian cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (2), (2010).</li><li>Pajoro, A., Mui&#241;o, J. M., Angenent, G. C., Kaufmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+Nucleosome+Occupancy+by+MNase-seq:+Experimental+Protocol+and+Computational+Analysis.">Profiling Nucleosome Occupancy by MNase-seq: Experimental Protocol and Computational Analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 1675, 167-181 (2018).</li><li>Giresi, P. G., Kim, J., McDaniell, R. M., Iyer, V. R., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FAIRE+(Formaldehyde-Assisted+Isolation+of+Regulatory+Elements)+isolates+active+regulatory+elements+from+human+chromatin.">FAIRE (Formaldehyde-Assisted Isolation of Regulatory Elements) isolates active regulatory elements from human chromatin.</a> Genome Research. 17 (6), 877-885 (2007).</li><li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding.">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Lu, Z., Hofmeister, B. T., Vollmers, C., DuBois, R. M., Schmitz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+ATAC-seq+with+nuclei+sorting+for+discovery+of+cis-regulatory+regions+in+plant+genomes.">Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes.</a> Nucleic Acids Research. 45 (6), e41 (2017).</li><li>Lara-Astiaso, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+state+dynamics+during+blood+formation.">Chromatin state dynamics during blood formation.</a> Science. 345 (6199), 943-949 (2014).</li><li>Gate, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

Het gewijzigde ATAC-seq-protocol gepresenteerd in dit artikel biedt reproduceerbare resultaten met minimale mitochondriaal DNA-besmetting. Het protocol is met succes gebruikt om zijn karakteriseren chromatine architectuur van menselijke primaire PBMCs10, menselijke monocyten, muis dendritische cellen (ongepubliceerd), en gekweekte melanoom cel lijnen11. Wij verwachten dat deze verbeterde lysis voorwaarde heeft het potentieel om te werken voor andere celtypes ook. Verwacht w...

De assay voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) is snel uitgegroeid tot de toonaangevende methode voor de raadpleging van de chromatine het platform. ATAC-seq herkent regio's van de toegankelijke chromatine door het proces van tagmentation, fragmenteren en tagging van DNA door het zelfde enzym, voor de productie van bibliotheken waarmee reeksnummers chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom kunt bepalen. Dit tagmentation proces wordt gemedieerd door de hyperactieve Tn5 transposase, die alleen open regio's van de chromatine als gevolg van nucleosomic sterische hinder snijdt. Als het snijdt, voegt de transposase van de Tn5 ook sequencing adapters waarmee voor snelle bibliotheek bouw door PCR en volgende-generatie sequentiebepaling van het genoom-brede toegankelijk chromatine1,2.
ATAC-seq is uitgegroeid tot de geprefereerde methode om te bepalen van de regio's van de chromatine toegankelijkheid als gevolg van de relatief eenvoudige en snelle protocol, de kwaliteit en de hoeveelheid informatie die kan worden bepaald uit de resultaten, en de kleine hoeveelheid grondstof nodig. Vergeleken met DNase-seq3 (die ook maatregelen genoom-brede chromatine toegankelijkheid), MNase-seq4 (die bepaalt nucleosoom posities open genoom regio), en de formaldehyde-gemedieerde FAIRE-seq5, ATAC-seq is sneller, goedkoper en meer reproduceerbare1. Het is ook meer gevoelig, werken met de grondstof voor zo weinig als 500 kernen, ten opzichte van de kernen van de 50 miljoen nodig voor DNase-seq3. ATAC-seq heeft ook de mogelijkheid om meer informatie over de architectuur van de chromatine dan andere methoden, met inbegrip van de regio's van transcriptie factor bindende, nucleosoom positionering en open chromatine regio's1. Effectieve, eencellige ATAC-seq-protocollen zijn gevalideerd, voorlichting over chromatine architectuur aan de eencellige niveau6,-7.
ATAC-seq is gebruikt voor het karakteriseren van chromatine het platform over een breed spectrum van onderzoek en cellen soorten, met inbegrip van planten8, mens9en vele andere organismen. Het is ook cruciaal voor het identificeren van Epigenetische regulatie van de ziekte staten7geweest. Het meest gebruikte ATAC-seq-protocol bevat echter het grote nadeel van besmetting sequencing leesbewerkingen van mitochondriaal DNA. In sommige datasets kunnen dit niveau van verontreiniging oplopen tot 60% van de volgorde van de resultaten1. Er is een gezamenlijke inspanning op het gebied om deze contaminerende mitochondriale leest zodat de meer efficiënte toepassing van ATAC-seq7,10,11. Hier presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol dat het mitochondriaal DNA verontreiniging tarief reduceert tot slechts 3%, waardoor vermindering van ongeveer 50% in sequencing kosten10. Dit wordt mogelijk gemaakt door een gestroomlijnd proces van activering, CD4 +-lymfocyten isolatie en een verbeterde lysis-buffermengsel die van essentieel belang bij het minimaliseren van mitochondriaal DNA besmetting.
Dit protocol modifiedATAC-seq is gevalideerd met een breed scala van primaire cellen, met inbegrip van de primaire perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)10, menselijke primaire monocyten en muis dendritische cellen (niet uitgegeven). Het is ook gebruikt met succes om te ondervragen melanoom cellijnen in een geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) scherm met niet-coderende elementen11. Daarnaast biedt het gegevenspakket analyse in dit protocol omschreven en aangeboden op GitHub nieuwe en ervaren onderzoekers met tools om ATAC-seq gegevens te analyseren. ATAC-seq is de meest effectieve assay chromatine toegankelijkheid over een gehele genoom in kaart, en wijzigingen in het bestaande protocol die hier worden geïntroduceerd onderzoekers om kwalitatief hoogwaardige gegevens met lage mitochondriaal DNA besmetting, te produceren zal toestaan sequencing kostenverlaging en het verbeteren van ATAC-seq doorvoer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq is uitgegroeid tot een veel gebruikte methodiek in de studie van de epigenetica vanwege zijn snelle en eenvoudige benadering van genoom-brede toegankelijk chromatine in kaart te brengen. In deze paper presenteren we een verbeterde ATAC-seq-protocol, dat vermindert de verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest. Terwijl vorige ATAC-seq protocollen hebben geworsteld met leest een gemiddelde van 50% besmetten mitochondriaal DNA, de geoptimaliseerde lysis-buffermengsel in dit protocol opgenomen vermindert mitochondriaal DNA besmetting tot een gemiddelde van 3%. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol voorziet in een in de omgeving van 50% vermindering van de kosten van het rangschikken. We laten zien hoe deze kwalitatief hoogwaardige ATAC-seq bibliotheken kunnen bereid worden uit geactiveerde CD4 +-lymfocyten, stapsgewijze instructies uit CD4 + lymfocyt isolement van volbloed door middel van data-analyse. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol in een breed scala van celtypes is gevalideerd en zullen voor onmiddellijk gebruik aan onderzoekers bestuderen van chromatine toegankelijkheid.

Van 15 mL vers volledig bloed genereert dit protocol een gemiddelde van 1 miljoen CD4 + T cellen. Dit kunnen worden ingevroren voor later te worden verwerkt of gebruikt onmiddellijk. Levensvatbaarheid van de CD4 + T-cellen, verse of ontdooide, was consequent > 95%. Deze methode van CD4 + T cel isolatie zorgt voor flexibiliteit in de bron-materiaal en collectie-tijd. Dit verbeterde ATAC-seq-protocol produceert een definitieve bibliotheek van meer dan 1 ng/µL voor het rangschikken. Kwalite...

Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een test voor transposase-toegankelijk chromatine sequencing (ATAC-seq) op de geactiveerde CD4 + menselijke lymfocyten. Het protocol is aangepast om het minimaliseren van verontreiniging van het mitochondriaal DNA leest van 50% tot 3% via de invoering van een nieuwe lysis-buffermengsel.

ATAC-seq Assay met lage mitochondriaal DNA besmetting van primaire menselijke CD4 + T lymfocyten

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Dit gewijzigde ATAC-seq protocol introduceert een nieuwe lysis buffer die vervuilende mitochondriale reads verlaagt van 50% naar minder dan 3%De verminderde mitochondriale besmetting zal onderzoekers in staat stellen om efficiëntere ATAC-seq uit te voeren met een 50% daling van de sequencing kosten. We hebben dit nieuwe ATAC-seq protocol gevalideerd in menselijke primaire PBMCs, menselijke primaire monocyten, muisdendrogtische cellen en melanoomcellijnen. Wij geloven dat het effectief zal zijn in een breed scala van celtypes.Het minimaliseren van monsterverlies tijdens het celactiverings- en selectieproces is van cruciaal belang voor het verkrijgen van hoogwaardige resultaten met ATAC-seq. We zullen aantonen hoe om te gaan met kleine aantallen cellen uit kostbare monsters met behulp van basislaboratoriumapparatuur. Om te beginnen ontdooien een flesje van eerder geïsoleerde CD4 + T cellen in een 37-graden Celsius waterbad totdat het ijs net is gesmolten.Breng de cellen vervolgens voorzichtig over op een conische buis van 15 milliliter met negen milliliter voorverwarmde volledige RPMI. Centrifugeren de cellen op 1, 500 keer G, en vier graden Celsius, gedurende zes minuten. Gooi vervolgens de supernatant weg en zet de pellet voorzichtig opnieuw op in twee milliliters van volledige RPMI.Na het herhalen van de centrifugatie, gooi de supernatant, en voorzichtig resuspend de cellen in 0,5 milliliter van volledige RPMI. Gebruik een hemocytometer om de cellen te tellen. Met behulp van volledige RPMI, pas de cel suspensie dichtheid aan plaat 50, 000 CD4 + cellen in 200 microliter per put van een 96-goed ronde bodem plaat.Vervolgens, om magnetische kralen voor te bereiden, aliquot 12,5 microliter van Human T-Activator CD3/CD28 kralen per ATAC-seq monster om een 1,5 milliliter buis. Voeg een milliliter 1x PBS toe aan de buis en plaats deze een minuut op een magneet om de kralen te wassen. Verwijder en gooi de heldere supernatant voorzichtig weg en verwijder de buis van de magneet.Resuspend de kralen in 13 microliter van volledige RPMI per ATAC-seq monster. Om de CD4+T-cellen met de aangepaste concentratie te activeren, verzamel je 500.000 cellen in 2,1 milliliter volledig RPMI-medium in een conische buis van 15 milliliter. Voeg 12,5 microliter menselijke T-Activator kralen, bereid en gewassen in eerdere stappen, en voorzichtig mengen door het omkeren van de buis.Breng de cellen, met kralen, voorzichtig over naar een steriel reservoir. Met behulp van een multi-channel pipet, plaat 200 microliters van cellen met kralen per put van een ronde-bodem 96-well plaat, en incubeer in een 37-graden Celsius, 5% CO2 incubator voor 48 uur. Na volledige incubatie, centrifugeren de plaat op 423 keer G, en kamertemperatuur, gedurende acht minuten.Verwijder 100 microliter medium uit elke put en verzamel het in een conische buis voordat u het weggooit, om geen kraalverlies te bevestigen. Dan resuspend de cel pellet in de resterende 100 microliter van medium, en verzamel alles in een 1,5-milliliter buis. Om CD4+-cellen te isoleren, voegt u 50 microliter voorgewassen CD4-geconjugeerde kralen toe aan 500,000 cellen in één milliliter volledige RPMI en omkeert u om te mengen.Incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius, terwijl de hand-flicking elke zes minuten te mengen. Plaats de buis twee minuten op de magneet, totdat supernatant duidelijk is, en verwijder en gooi deze weg. Haal de buis uit de magneet.Was de kraalgebonden cellen door ze opnieuw in één milliliter PBS te gebruiken, plus 2%FCS, en plaats de buis gedurende één minuut terug op de magneet. Gooi de duidelijke supernatant weg en herhaal dit proces voor een totaal van drie wasbeurten. Na de laatste wasbeurt, plaats de buis op de magneet voor een minuut.Verwijder het, gooi de supernatant weg en leg de pellet op ijs. Vervolgens om kernisolatie uit te voeren, de kralen en cellen opnieuw op te zetten in 50 microliter van koude lysebuffer, en onmiddellijk te centrifugeren bij 500 G, vier graden Celsius, gedurende 10 minuten. Verwijder en gooi de supernatant weg.Om de transposasereactie uit te voeren, wordt de geïsoleerde kernenpellet opnieuw opgetrokken met 50 microliter van Tn5-transposasemix. Incubeer in een thermocycler gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, met het deksel ingesteld op 40 graden Celsius, en houd dan op vier graden Celsius wanneer voltooid. Direct na het thermocycling, voer een snelle bank-top centrifuge spin-down.Plaats de buis gedurende een minuut op de magneet om de kralen uit het product te verwijderen. Zonder de buis uit de magneet te verwijderen, breng je de heldere supernatant over naar een DNA-zuiveringskolom. Was de kolom eenmaal met 250 microliters pbbuffer en twee maal met 750 microliter PE-buffer.Voeg vervolgens 10 microliter elutie buffer toe om het monster te ontwijken. Stel de eerste PCR-versterkingsreactie in een nuclease-vrije PCR-buis in. Plaats de PCR-buis in de thermocycler en voer het PCR-versterkingsprogramma uit.Voltooi vervolgens de definitieve PCR-versterking van de resterende 45 microliters van PCR-reactie, zoals beschreven in het manuscript. Plaats de PCR-buis in de thermocycler en voer het programma uit. Na volledige versterking, zuiveren van de bibliotheken met behulp van een PCR cleanup kit, volgens het protocol van de fabrikant, eluting in 25 microliters van de elutie buffer.Volg de voorbereide bibliotheken op een sequencer van de volgende generatie tot een gemiddelde leesdiepte van 42 miljoen leest per steekproef. Dit verbeterde ATAC-seq protocol produceerde een definitieve bibliotheek van meer dan een nanogram per microliter voor sequencing. Kwaliteitscontrole toonde DNA-fragmenten tussen 200 en 1.000 basisparen, en verdere sequencing werd uitgevoerd met deze hoogwaardige bibliotheken.Bibliotheken die volgens dit protocol waren opgesteld, vertoonden slechts 3%mitochondriale verontreiniging. Het hoge percentage bruikbare reads is voldoende constant over biologische replica's. Dit protocol leverde zeer reproduceerbare resultaten op voor technische replica's, evenals biologische replica's.Bovendien duurde dit protocol 48 uur, in plaats van een week of meer zoals eerder beschreven, wat resulteerde in consistente en efficiënte activering, zoals blijkt uit reproduceerbare sequencing resultaten. Bovendien werden voorspelde ATAC-seq pieken nauwkeurig genoemd door de analysepijplijn. Sequencing resultaatanalyse bleek duidelijke veranderingen in chromatine toestand tijdens de menselijke T-cel activering.Tussen zes monsters vóór en 48 uur na de activering werden differentiaal toegankelijke gebieden van open chromatine geïdentificeerd. Zorg ervoor dat de kernlysereactie wordt uitgevoerd met gekoelde reagentia en materialen, om het herstel van intacte kernen te maximaliseren. Onze gemodificeerde kernen lyse buffer is zachter op de cellen, en minimaliseert vervuilende mitochondriaal DNA.We kijken ernaar uit om deze gewijzigde lysis buffer wordt toegepast op single-nuclei ATAC-seq ook. We weten dat dit protocol onderzoekers in staat zal stellen om atac-seq-gegevens van hogere kwaliteit te produceren tegen lagere kosten, waardoor het epigenetische veld kan worden doorgestuurd. Het protocol is eenvoudig, snel en vereist geen gevaarlijke reagentia of instrumenten, waardoor het gemakkelijk toegankelijk is voor degenen die nieuw zijn bij ATAC-seq.

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Ontwerp en gebruik van een Low Cost, Automatiseren Morbidostat voor Adaptive evolutie van bacteriën onder antibioticum selectie

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

In Situ Labeling van mitochondriaal DNA-replicatie in Drosophila volwassen Eierstokken van Edu kleuring

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

Beoordeling van DNA besmetting in RNA Samples gebaseerd op Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoleren, Sequencing en analyseren van extracellulaire MicroRNAs van menselijke mesenchymale stamcellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Lentivirale gemedieerde gen-uitschakeling in humaan pseudo-eilandje bereid in lage bevestigings platen

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Tumorsphere afleiding en behandeling van primaire tumor cellen geïsoleerd van de muis Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Microsatelliet DNA genotypering en flow Cytometrie ploidy analyses van Formalin-vaste paraffine-ingesloten Hydatidiforme molaire weefsels

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Multicolor DNA FISH Tool om nucleaire architectuur in menselijke primaire cellen te bestuderen

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...