Name: atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes at JoVE.com

Nous remercions Atsede Siba pour le support technique. C.S.C. est pris en charge par les NIH grant 1R61DA047032.

Ce protocole amélioré fournit des instructions détaillées pour l’exécution de ATAC-seq des lymphocytes CD4 +, de la matière première de sang grâce à l’analyse de données (Figure 1).
1. isolement des cellules de T CD4 + du sang total
Remarque : Le produit de départ pour ce protocole est de 15 mL de sang total frais prélevé à l’aide de procédures standards, permettant à la source des matières premiè...

<ol>
	<li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin,+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position.">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li><li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATAC-seq:+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide.">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li><li>Song, L., Crawford, G. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+determinants+of+co-accessible+chromatin+regions+in+activated+T+cells+across+humans.">Genetic determinants of co-accessible chromatin regions in activated T cells across humans.</a> Nature Genetics. , (2018).</li><li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome.">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li><li>. FastQC A Quality Control tool for High Throughput Sequence Data. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</a> (2018)</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+ATAC-seq+protocol+reduces+background+and+enables+interrogation+of+frozen+tissues.">An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues.</a> Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).</li><li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+landscape+of+accessible+chromatin+in+mammalian+preimplantation+embryos.">The landscape of accessible chromatin in mammalian preimplantation embryos.</a> Nature. 534 (7609), 652-657 (2016).</li></ol>

ATAC-seq mis à jour le protocole présenté dans cet article fournit des résultats reproductibles avec une contamination ADN mitochondriale minimale. Le protocole a été avec succès utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine des humains primaires PBMC10, des monocytes, cellules dendritiques de souris (non publiées) et cellules de mélanome cultivées les lignes11. Nous prévoyons que cette amélioration lyse condition a la possibilité de travailler ...

Le dosage pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) est rapidement devenu la principale méthode pour interroger l’architecture de la chromatine. ATAC-seq peut identifier les régions de chromatine accessible à travers le processus de tagmentation, la fragmentation et le marquage de l’ADN par la même enzyme, pour produire des bibliothèques avec laquelle séquençage peut déterminer l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier. Ce processus de tagmentation est médié par la transposase Tn5 hyperactif, qui ne coupe que les régions ouvertes de la chromatine en raison de l’encombrement stérique nucleosomic. Qui le touche, la transposase Tn5 insère également des adaptateurs de séquençage qui permettent la construction rapide de bibliothèque par PCR et génération séquençage du génome de chromatine accessible1,2.
ATAC-seq est devenue la méthode préférée pour déterminer les régions de l’accessibilité de la chromatine en raison du protocole relativement simple et rapide, la qualité et la quantité d’information qui peut être déterminée de ses résultats et une petite quantité de matériel requis de départ. Par rapport à DNase-seq3 (qui mesure également l’accessibilité de la chromatine génome-large), MNase-seq4 (qui détermine les positions des nucléosomes dans régions génomiques ouvert), et le formaldéhyde-mediated FAIRE-seq5, ATAC-seq est plus rapide, moins cher et plus reproductible1. Il est aussi plus sensible, avec matériel d’aussi peu que 500 noyaux, par rapport aux 50 millions requis pour DNase-seq3noyaux de départ. ATAC-seq a également la possibilité de fournir plus d’informations sur l’architecture de la chromatine que d’autres méthodes, y compris les régions de liaison de facteur de transcription, positionnement des nucléosomes et régions de chromatine ouverte1. Efficaces, monocellulaires ATAC-seq protocoles ont été validés, fournissant des informations sur l’architecture de la chromatine à la cellule unique niveau6,7.
ATAC-seq a été utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine dans un large éventail de types de cellules et de la recherche, y compris les plantes8humains9et beaucoup d’autres organismes. Il a également été essentiel dans l’identification de régulation épigénétique de la maladie États7. Cependant, le plus largement utilisé du protocole ATAC-seq inclut l’inconvénient majeur de contamination lectures de séquençage de l’ADN mitochondrial. Dans certaines bases de données, ce niveau de contamination peut être aussi haut que 60 % de séquencer les résultats1. Il y a un effort concerté dans le domaine de réduire ces contaminants lectures mitochondriales afin de permettre l’application plus efficace de ATAC-seq7,10,11. Nous présentons ici un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit le taux de contamination de l’ADN mitochondrial, à seulement 3 %, permettant de réduire d’environ 50 % de coûts de séquençage10. Ceci est rendu possible par un processus simplifié de CD4 + lymphocytes d’isolement et d’activation et un tampon de lyse améliorée qui est essentielle pour réduire au minimum la contamination de l’ADN mitochondriale.
Ce protocole modifiedATAC-seq a été validé avec une large gamme de cellules primaires, y compris le sang périphérique primaire humain cellules mononucléaires (PBMC)10, des monocytes humains primaires et les cellules dendritiques de souris (non publiées). Il a également été utilisé avec succès pour interroger des lignées de cellules de mélanome dans un écran régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster de non-codage éléments11. En outre, le progiciel d’analyse de données décrites dans le présent protocole et fourni sur GitHub fournit des chercheurs débutants et expérimentés avec des outils pour analyser les données de l’ATAC-seq. ATAC-seq est le dosage plus efficace pour cartographier l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier, et les modifications au protocole existant qui sont introduites ici permettra aux chercheurs de produire des données de haute qualité avec une faible contamination de l’ADN mitochondriale, réduction des coûts de séquençage et améliorant le débit ATAC-seq.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1X PBS, Sterile</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5810/5810&#160;R Swing Bucket Refrigerated Centrifuge with 50 mL, 15 mL, and 1.5 mL Tube Buckets</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22625501</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Round Bottom Plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>163320</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 4200 Tape Station System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2991AA</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>374081</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8418</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11131D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>11346D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamagnet</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>Gemini Bio Products</td>
			<td>100-500</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>50674626</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride, Hexahydrate, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2393</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR Purification Kit (Buffer PB, Buffer PE, Elution Buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28004</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl, Molecular Biology Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext High Fidelity 2X PCR Master Mix</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0541</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2X TD Buffer, Tn5 Enzyme)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC1211030</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease Free Sterile dH20</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polysorbate 20 (Tween20)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>A25780</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSGP02</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit FlouroMeter</td>
			<td>Invitrogen Life Technologies</td>
			<td>Q33226</td>
			<td>Suggested for quality assessment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15705</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>15022</td>
			<td>Critical Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875093</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Resevoir</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8096-11</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermocycler with Heated Lid</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5941</td>
			<td>Can use other comparable products.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atac-seq assay with low mitochondrial dna contamination from primary human cd4+ t lymphocytes

ATAC-seq est devenu une méthode largement utilisée dans l’étude de l’épigénétique en raison de son approche simple et rapide à la cartographie de la chromatine accessible de tout le génome. Dans cet article, nous présentons un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit la contamination lectures d’ADN mitochondriales. Alors que les précédents protocoles ATAC-seq ont lutté avec une moyenne de 50 % la contamination de l’ADN mitochondrial se lit, le tampon de lyse optimisé présenté dans le présent protocole réduit la contamination d’ADN mitochondriale à une moyenne de 3 %. Ce protocole de ATAC-seq amélioré permet de presque 50 % de réduction dans le coût du séquençage. Nous démontrons comment ces bibliothèques ATAC-seq de haute qualité peuvent être préparés de lymphocytes CD4 + activés, fournissant des instructions étape par étape de CD4 + isolation de lymphocytes du sang total par le biais de l’analyse des données. Ce protocole ATAC-seq amélioré a été validé dans un large éventail de types de cellules et sera d’une utilité immédiate aux chercheurs qui étudient l’accessibilité de la chromatine.

A partir de 15 mL de sang total frais, ce protocole génère une moyenne de 1 million de cellules T CD4 +. Ceux-ci peuvent être congelés pour un traitement ultérieur ou utilisés immédiatement. La viabilité des cellules T CD4 +, fraîches ou décongelées, était systématiquement > 95 %. Cette méthode d’isolement de cellules T CD4 + permet une flexibilité dans le temps de matériel et de la collection source. Ce protocole ATAC-seq amélioré produit une bibliothèque finale sup?...

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

Nous présentons ici un protocole pour effectuer un test pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) sur activé CD4 + lymphocytes humains. Le protocole a été modifié pour réduire au minimum la contamination mitochondrial DNA lectures de 50 % à 3 % grâce à l’introduction d’une nouvelle mémoire tampon de lyse.

ATAC-seq test ADN Mitochondrial faible contamination de primaires humaines CD4 + Lymphocytes T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Ce protocole ATAC-seq modifié introduit un nouveau tampon de lyse qui diminue la contamination des lis mitochondriales de 50% à moins de 3%La diminution de la contamination mitochondriale permettra aux chercheurs d’effectuer un ATAC-seq plus efficace avec une diminution de 50% des coûts de séquençage. Nous avons validé ce nouveau protocole ATAC-seq chez les PBMCs primaires humains, les monocytes primaires humains, les cellules dendritiques de souris et les lignées cellulaires du mélanome. Nous croyons qu’il sera efficace dans un large éventail de types de cellules.Il est essentiel de minimiser la perte d’échantillon pendant le processus d’activation et de sélection des cellules pour obtenir des résultats de haute qualité avec ATAC-seq. Nous démontrerons comment manipuler un petit nombre de cellules à partir d’échantillons précieux à l’aide d’équipement de laboratoire de base. Pour commencer, décongelez un flacon de cellules CD4+T précédemment isolées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la glace ait fondu.Ensuite, transférez doucement les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de RPMI complet préchauffé. Centrifuger les cellules à 1500 fois G, et quatre degrés Celsius, pendant six minutes. Puis jetez le supernatant, et resuspendez doucement la pastille en deux millilitres de RPMI complet.Après avoir répété la centrifugation, jeter le supernatant, et doucement resuspendre les cellules en 0,5 millilitres de RPMI complet. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. À l’aide d’un RPMI complet, réglez la densité de la suspension cellulaire à la plaque 50 000 cellules CD4+, en 200 microlitres par puits d’une plaque à fond rond de 96 puits.Ensuite, pour préparer des perles magnétiques, aliquot 12,5 microlitres de perles humaines T-Activateur CD3/CD28 par échantillon ATAC-seq à un tube de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de 1x PBS au tube, et le placer sur un aimant pendant une minute pour laver les perles. Retirez et jetez soigneusement le surnatant clair et retirez le tube de l’aimant.Resuspendez les perles dans 13 microlitres de RPMI complet par échantillon ATAC-seq. Pour activer les cellules CD4+T avec la concentration ajustée, recueillir 500 000 cellules dans 2,1 millilitres de milieu RPMI complet dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter 12,5 microlitres de perles human t-activateur, préparées et lavées dans les étapes précédentes, et mélanger délicatement en inversant le tube.Ensuite, transférez doucement les cellules, avec des perles, dans un réservoir stérile. À l’aide d’une pipette multicanal, plaquez 200 microlitres de cellules avec des perles par puits d’une plaque ronde de 96 puits et incubez dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de CO2 à 5 % pendant 48 heures. Après incubation complète, centrifuger la plaque à 423 fois G, et température ambiante, pendant huit minutes.Retirer 100 microlitres de milieu de chaque puits et les recueillir dans un tube conique avant de les jeter, afin de confirmer qu’il n’y a pas de perte de perles. Puis résuspendez la pastille cellulaire dans les 100 microlitres restants de milieu, et de recueillir tout dans un tube de 1,5 millilitre. Pour isoler les cellules CD4+, ajouter 50 microlitres de perles conjuguées CD4 prélavées à 500 000 cellules dans un millilitre de RPMI complet, et inverser pour mélanger.Incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, tout en feuilletant à la main toutes les six minutes pour mélanger. Placez le tube sur l’aimant pendant deux minutes, jusqu’à ce que le surnatant soit clair, puis retirez et jetez. Retirez le tube de l’aimant.Lavez les cellules liées aux perles en les réutilisant dans un millilitre de PBS, plus 2% FCS, et placez le tube sur l’aimant pendant une minute. Jetez le supernatant clair, et répétez ce processus pour un total de trois lavages. Après le lavage final, placez le tube sur l’aimant pendant une minute.Retirez-le, jetez le surnatant et placez la pastille sur la glace. Ensuite, pour effectuer l’isolement des noyaux, résuspendez les perles et les cellules dans 50 microlitres de tampon de lyse froide, et centrifugeuse immédiatement à 500 G, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes. Retirer et jeter le surnatant.Pour effectuer la réaction de transposase, resuspendez la pastille de noyaux isolée avec 50 microlitres de mélange de transposase Tn5. Incuber dans un thermocyclre pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, avec le couvercle réglé à 40 degrés Celsius, puis tenir à quatre degrés Celsius une fois terminé. Immédiatement après le thermocyclisme, effectuez une centrifugeuse rapide.Placez le tube sur l’aimant pendant une minute pour enlever les perles du produit. Sans enlever le tube de l’aimant, transférez le supernatant clair dans une colonne de purification de l’ADN. Lavez la colonne une fois avec 250 microlitres de tampon PB, et deux fois avec 750 microlitres de tampon PE.Ajouter ensuite 10 microlitres de tampon d’élitution pour élucider l’échantillon. Configurer la réaction initiale d’amplification pcr dans un tube PCR sans nucléase. Placez le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR.Ensuite, complétez l’amplification pcr finale des 45 microlitres restants de réaction PCR, tel que décrit dans le manuscrit. Placez le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme. Après amplification complète, purifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de nettoyage PCR, suivant le protocole du fabricant, en 25 microlitres du tampon d’élitution.Séquencez les bibliothèques préparées sur un séquenceur de nouvelle génération à une profondeur de lecture moyenne de 42 millions de lecture par échantillon. Ce protocole ATAC-seq amélioré a produit une bibliothèque finale de plus d’un nanogramme par microlitre pour le séquençage. Le contrôle de la qualité a montré des fragments d’ADN entre 200 et 1000 paires de base, et d’autres séquençages ont été effectués avec ces bibliothèques de haute qualité.Les bibliothèques préparées à la suite de ce protocole n’ont montré qu’une contamination mitochondrique de 3 %. Le pourcentage élevé de lectures utilisables est suffisamment constant entre les répliques biologiques. Ce protocole a fourni des résultats hautement reproductibles à travers des répliques techniques, ainsi que des répliques biologiques.En outre, ce protocole a pris 48 heures, plutôt qu’une semaine ou plus comme décrit précédemment, ayant pour résultat l’activation cohérente et efficace, comme démontré par des résultats reproductibles de séquençage. De plus, le pipeline d’analyse a appelé avec précision les pics prévus d’ATAC-seq. L’analyse des résultats de séquençage a révélé des changements clairs dans l’état de chromatine pendant l’activation humaine des cellules T.Des régions différemment accessibles de chromatine ouverte ont été identifiées entre six échantillons avant et 48 heures après l’activation. Assurez-vous que la réaction de lyse des noyaux est effectuée avec des reagents et des matériaux réfrigérés, afin de maximiser la récupération des noyaux intacts. Notre tampon de lyse de noyaux modifiés est plus doux sur les cellules, et minimise la contamination de l’ADN mitochondrial.Nous attendons avec intérêt que ce tampon modifié de lyse soit appliqué aux noyaux simples ATAC-seq aussi bien. Nous savons que ce protocole permettra aux chercheurs de produire des données ATAC-seq de meilleure qualité à un coût réduit, ce qui aidera à faire avancer le champ épigénétique. Le protocole est simple, rapide et ne nécessite aucun réaccélément ou instrument dangereux, ce qui le rend facilement accessible aux nouveaux atac-seq.

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Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Lentiviral Mediated Gene Silencing in Human Pseudoislet Prepared in Low Attachment Plates

Le silençage du gène médiévirus lentiviral dans le pseudoislet humain préparé dans les plaques à faible attachement

Various genetic tools are available to modulate genes in pancreatic islets of rodents to dissect function of islet genes for diabetes research. However, ...

Tumorsphere Derivation and Treatment from Primary Tumor Cells Isolated from Mouse Rhabdomyosarcomas

Dérivation et traitement de la tumorale à partir de cellules tumorales primaires isolées de la souris Rhabdomyosarcomas

Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft tissue sarcoma in children. Although significant efforts have enabled the identification of common ...

Microsatellite DNA Genotyping and Flow Cytometry Ploidy Analyses of Formalin-fixed Paraffin-embedded Hydatidiform Molar Tissues

Génotypage de l'ADN microsatellite et cytométrie des flux Analyses des tissus Hydatidiform Hydradins intégrés paraffins fixés à la formaline

Hydatidiform mole (HM) is an abnormal human pregnancy characterized by excessive trophoblastic proliferation and abnormal embryonic development. There are ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

3D Multicolor DNA FISH Outil pour étudier l'architecture nucléaire dans les cellules primaires humaines

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...